新型烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展

1、新型烯二快类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展【关键词】力达霉素；，烯二焕类抗生素；，抗肿瘤摘要：带有烯二焕结构发色团的抗肿瘤抗生素力达霉素对肿瘤细胞有极强的杀伤力，是最近几年来发觉的抗肿瘤活性较强的化合物之一，在肿瘤的化学医治方面有良好的应用前景。本文介绍力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面研究的最新进展。关键词：力达霉素；烯二烘类抗生素；抗肿瘤Advancesintheresearchoflidamycin,anenediyneantitumorantibioticMaDiandHongBin(InstituteofMedi

2、cinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050)ABSTRACTLidamycinisanenediyneantitumorantibioticwithpotentcytotoxicityagainstvarietiesofcancercelllines.Itisconsideredasoneofthemosteffectivenaturalproductswithantitumorbiologicalactivityfoundinrecentyearsandi

3、sexpectedtohavegreatpotentialonthechemotherapyofcancers.Thisarticlereviewstherecentresearchprogressoflidamycin,focusingonitsmolecularstructure,biosynthesis,molecularmechanismofaction,antitumoreffects,conjugationwithmonoclonalantibody,aswellastheprospectiveofcombinatorialbiosynthesisofthisclassofanti

4、biotics.KEYWORDSLidamycin;Enediyneantibiotics;Antitumor力达霉素(lidamycin,LDM)是从我国湖北省潜江县土壤分离出的一株放线菌StreptomycesglobisporusC1027代谢产物中挑选出的1个新的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素。力达霉素的化学结构中含有烯二焕结构的发色团，是烯二蝶类抗生素中重要的成员之一。近两年来，由于烯二烘类的抗生素化合物分子组成新颖并有极强的抗肿瘤活性，已成为化学、药理学、分子生物学的研究热点。目前针对力达霉素的多方面的研究工作己取得的长足进展。现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗

5、肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面的研究工作功效作一综述。1力达霉素的分子结构与生物合成力达霉素为新型烯二烘类抗肿瘤抗生素，它由1个辅基蛋白和1个发色团组成。蛋白部份由110个氨基酸组成，含有2个分子内二硫键，计算相对分子质量为10500U,蛋白质部份没有抗肿瘤活性，但对发色团有稳固和爱惜作用，并携带发色团抵达肿瘤部位。发色团在抗肿瘤活性中发挥要紧作用1-3,发色团由1个9元环1,5二焕3烯核心结构与氮氧杂蔡甲酸、氨基毗咤核糖和P酪氨酸结合而成中1）。这些结构单元不但参与化合物分子的组成，而且与化合物的生物活性紧密相关。借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确

6、信各个结构单位的相对位置，发觉芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水口袋”处，它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成的静电和疏水作用4。发色团核心的烯二焕结构的生物合成途径一直是人们关注的核心。烯二烘结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径，由烯二烘聚酮合成酶催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成，接着采纳一种新颖的环化机制而形成烯二烛核心结构。刘文等5运用PCR方式成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dXTP葡萄糖4,6脱水酶基因（sgcA）,并以此为探针，通过基因文库挑选和染色体步移克隆了完

7、整的生物合成基因簇，发觉力达霉素的生物合成起源于聚酮代谢途径，并确信了基因簇编码1个烯二烘聚酮合成酶SgcE,排除由脂肪酸合成然后降解的可能性。除聚酮合成酶SgcE,刘文等5还提出了一系列途径特异的结构基因别离操纵各个结构单元的合成。sgcEsgcEl一、sgcl、sgcj、sgcL和sgcF等16个基因负责烯二块核心的合成；sgcAsgcA6等7个基因sgcAlsgcA6参与脱氧氨基糖的合成;sgcCsgcC5等6个基因参与3氨基酸的合成sgcDsgcD6等7个基因负责杂蔡苯环的合成。通过各自途径生物合成的这三个结构单元别离在糖基转移酶(SgcA6)、缩合酶(SgcC5)和酰基转移酶(Sgc

8、D6)的催化作用下，与烯二烘核心结合，组成完整的力达霉素发色团分子。对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中，通过生物信息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验和利用基因工程手腕将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析能够确信这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能，并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反映步骤的信息。目前己陆续报导了sgcD、sgcA、sgcCl等结构基因的研究分析结果ThechromophorestructureoflidamycinanditsMasamuneBergmanrearragement(polyketidesynthase,

9、PKS)(略)2力达霉素化学合成的研究在力达霉素的化学结构取得解析后，很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作，希望通过化学手腕能够合成出活性相当乃至更强的化合物。依照逆合成份析，朱锦桃等11,12合成了烯二焕发色团中五元环状中间体，并在此基础上合成了发色团中烯二焕单元的开链衍生物，但并未取得闭环的烯二烘结构。Inoue等13,14在对发色团的结构进行了充分研究以后对发色团的骨架结构和烯二烘的双环结构进行了合成。由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解，该实验室还利用同位素笊(D)取代辅基蛋白Gly96的H原子，改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团

10、结构降解的速度，增加其稳固性15。Semmelhack等16报导了由甘露糖动身经12步反映合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的线路，以为合成反映的关键步骤在于C4位的内部N取代从而引入顺式氨基和C5位上烯醇化物的甲基化。3力达霉素的分子作用机制与抗肿瘤活性分子作用机制力达霉素的发色团与DNA小沟彼此作用，造成DNA损伤，且有序列特异性，为富含AT的区域。如CTTTT/AMAG,ATAAT/ATTAT,CTTTA/TAAAG,CTCTT/AAGAG,专门是在GTTAT/ATAAC处17,力达霉素与双螺旋DNA小沟结合后插入DNA中，现在药物并未引发DA的断裂，发色团中1)经MasamuneBerg

11、man重排后芳构化转变成有活性的双游离基中间体中2),然后夺取DA脱氧核糖上的氢原子中3),在有氧条件下使核糖基团氧化，引发DNA单链、双链断裂或形成无碱基位点；在厌氧条件下DXA互补双链的脱氧核糖自由基与药物分子共价作用形成DXA的链内交联18。在力达霉素切割DXA的进程中自由基中间体的存在能够通过电子自旋共振(electronspinresonance,ESR)技术取得直接有力的证明19。力达霉素对细胞DNA复制的阻碍力达霉素不但能够造成DXA断裂，同时还抑制DNA复制。使劲达霉素处置SV40、EB病毒感染的细胞，然后通过研究SV40、EB病毒的DXA观看力达霉素对细胞DXA可能造成的阻碍

12、。实验结果发觉力达霉素抑制SV40、EB病毒DNA的复制,低浓度力达霉素抑制DNA复制可能与复制蛋白A(RPA)功能的丧失有美,而在高浓度的力达霉素作用下DNA断裂产生的片段能够诱导DNA依托的蛋白激酶(DXAPK)活性增高，使其作为反式作用抑制因子阻碍DNA的复制2022。力达霉素引发细胞凋亡、细胞周期阻滞和细胞裂亡宋旭等23利用nucleicacidarrays的方式将细胞总cDNA进行膜杂交,可同时检测出大量基因表达的转变，发觉力达霉素改变了HCT28细胞多种凋亡相关基因的表达水平，抑制RhoC的表达，增进TRAF3、DR4、DR五、MCH4、MCH六、TRIP、Apo23、ABLL和S

13、TAT1的表达，提示力达霉素可能是通过调剂TNF受体家族有关的凋亡信号进程，诱导肿瘤细胞凋亡。用低浓度的力达霉素处置人肝癌BEL7402细胞，力达霉素增进凋亡相关基因cmyccfos的表达并抑制在肝细胞癌变中起重要作用的nras基因的表达，同时细胞骨架也发生了明显的转变，微丝排列更整齐，向正常细胞的微丝形态转变。力达霉素引发肿瘤细胞骨架有关组分的转变可能是其抗肿瘤活性的另一种说明24。有研究说明高剂量力达霉素处置人红白血病K562细胞引发S期细胞的比例明显升高，死亡细胞的比例明显增加，提示力达霉素引发DNA的损伤发生在S周期时，细胞周期查验点被激活，进而阻止DNA的复制，同时启动DNA修复机制

14、，或诱发细胞凋亡25。力达霉素对DA的断裂损伤能够引发细胞周期的阻滞，实验结果显示力达霉素抑制内皮细胞增殖并诱导细胞凋亡，低浓度的力达霉素可使内皮细胞被阻滞在G/M1期；高浓度的力达霉素诱导细胞凋亡的发生。同时力达霉素改变内皮细胞中与增殖和凋亡相关的基因的表达，下调抗细胞凋亡蛋白Bcl2和PCNA的表达水平。细胞内游离钙离子浓度也显著的升高，提示由力达霉素引发的细胞凋亡可能与钙离子内流或阻碍钙离子依托的下游信号传导通路有必然关联26。何其扬等27报导了力达霉素在BEL7402活细胞内直接切割DXA可形成梯度条带，并第一次观看到染色质凝集的现象，而在其他烯二焕类抗生素诱导细胞凋亡的研究中均未见报

15、导此现象。现己公认的细胞凋亡后期的一起途径是caspases（半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶）的激活。通过测定caspase的活性及与染色质凝集的关系，以为染色质凝集发生的时刻早于caspase达到顶峰的时刻，而少量caspase的活化不足以说明大量的细胞发生染色质凝集的现象。这一现象提示这种染色质凝集的方式有别于典型的细胞凋亡。力达霉素引发细胞死亡（也被称为裂亡）的特点有别于典型细胞凋亡，而裂亡的引发可能与力达霉素诱导的细胞有丝割裂的异样（如中心体的过度复制、多极性纺锤体的形成、多核的形成等)有关28,力达霉素在HCT116细胞中造成染色体异样并破坏端粒区的功能，这是由于力达霉素诱导的大量双链

16、DNA断裂引发细胞采取非同源结尾结合(NHEJ)方式的修复途径，致使染色体发生错误连接29。力达霉素对肿瘤细胞的抑制作用及实验医治观看力达霉素对多种肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，对人肺癌、人鼻咽癌、人胃癌细胞等均有强烈的细胞毒作用。尚伯阳等30报导力达霉素对体外培育的肝癌细胞有高度杀伤作用。单核细胞直接细胞毒性测定(MTT)法测定结果说明，力达霉素对人肝癌BEL7402和小鼠肝癌22细胞增生有强烈的抑制作用，抑瘤率呈剂量依托性。以IC50相较较，力达霉素细胞毒性比丝裂霉素C强10000倍以上。力达霉素对小鼠移植性结肠癌(皮下、盲肠、肝内)生长有明显抑制作用，对肝转移也有显著抑制作用，尤其是对较大

17、转移灶有更强的抑制作用31。力达霉素的对肿瘤的抑制还表此刻具有抑制肿瘤血管生成和抗侵袭作用。bFGF是重要的肿瘤血管生成因子，肿瘤生成时，贮存于细胞基质中的bFGF被大量释放出来，同时肿瘤细胞中bFGF的基因表达及生物合成异样活跃。甄红英等32利用鸡胚尿囊膜模型证明力达霉素是很强的血管生成抑制剂。实验还证明力达霉素对bFGF与其受体结合有明显抑制作用，提示力达霉素抑制bFGF与受体结合，阻断bFGF在血管生成进程中诱导内皮细胞的增生和迁移，抑制血管生成、肿瘤生长及抗肿瘤转移。还有研究显示，力达霉素对侵袭调剂基因的表达可产生必然阻碍，增进人结肠癌HCT8细胞TIMP21基因的表达，抑制MMP9基

18、因的表达从而抑制IV型胶原酶的产生，同时又诱导金属蛋白酶抑制因子的产生，表现出抗侵袭活性33。力达霉素与其他临床经常使用抗肿瘤药物的联合应用能够表现出更强的抑癌成效，有实验观看到力达霉素能够增强顺伯诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡，增强顺伯的抗肿瘤作用。顺伯与力达霉素单用都可使抗凋亡蛋白Bc12的表达水平降低，而顺伯与力达霉素联合应用后那么强烈抑制Bcl2的表达，几乎达到检测不到的水平,提示增效机制可能在于联合应用降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平，致使线粒体膜电位降低，破坏线粒体膜的稳固性，线粒体内钙离子外流至细胞质，进一步诱导细胞凋亡34。最近有报导quinacrinenetropsin(Q

19、N)的杂交分子与力达霉素一起利用能够显著增强力达霉素诱导双链DXA断裂和细胞凋亡的程度，由于QN为DXA结合配体，加入QN后力达霉素可能与之形成异源二聚体后改变了和DNA序列结合的位点特异性，增强了在富含GC的区域，专门是5,AGG3/3TCC5处的切割。因此，对DNA结合配体的研究可能成为增强力达霉素抗肿瘤活性、减小其化疗应用中副作用的一条有效途径35。4C1027与单克隆抗体高效偶联物的研究力达霉素对肿瘤细胞的高效杀伤力使其极有可能成为新型高效抗肿瘤药物，可是缺乏肿瘤特异性的缺点限制了力达霉素应用于化疗。一种行之有效的增强特异性杀伤肿瘤细胞的方式确实是将力达霉素作为高效“弹头”用于研制小型

20、化导向药物。由于C1027分子组成的特点，可用多种方式将C1027与单抗连接。抗IV型胶原酶单抗3G11与力达霉素的偶联物3G11LDM与肿瘤细胞H2二、HT2九、C26呈现出良好的免疫结合活性和较高的抑癌活性。3G11LDM偶联物通过抗IV型胶原酶单抗3Gli携带力达霉素抵达肿瘤部位实现特异性结合,提高了在肿瘤部位释放的力达霉素的浓度，使其发挥更强的抑瘤作用36。完整的单抗分子与药物的免疫偶联物存在分子量大、对实体瘤穿透力差、易产生人抗体抗鼠反映(HAMA)等缺点，最近几年来设计高效化、小型化的单抗免疫偶联物也一直成为研究的热点。例如力达霉素与大鼠抗人肝癌细胞单抗3A5的Fab片段的偶联物F

21、abLDM,偶联物比游离力达霉素对靶细胞BEL7402细胞集落生成的抑制作用显著增强，偶联物与等剂量游离力达霉素比较,对小鼠移植性结肠癌26细胞显示出更强和更长时刻的抑瘤作用37。以IV型胶原酶为医治靶点，制备单抗3GllFab片段与力达霉素偶联的小型化免疫偶联物对肝癌细胞H22的细胞毒和医治作用较游离力达霉素均有显著提高38。除化学偶联的方式外，利用基因工程技术将抗体Fv片段和C1027的烯二焕发色团制成份子量仅为387ku的融合蛋偶联物己取得成功。这也为利用基因工程进一步进行scFv与烯二焕偶联的研究奠定了基础39。5力达霉素的组合生物合成通过化学全合成的方式取得结构复杂的力达霉素及其结构

22、类似物，以增进作用机制和临床应用的研究尽管己经取得了必然进展，但由于化学结构的高度复杂性，化学全合成力达霉素仍然面临诸多困难，利用这一手腕增进临床应用的前景也超级有限。作为有机合成的重要补充，最近几年来进展的组合生物合成技术为复杂天然产物及其类似物的取得提供了一条生物合成的方式。例如通过增加力达霉素的结构基因拷贝数有可能冲破生物合成限速酶的催化瓶颈，使力达霉素的产量在原有基础上大大提高。力达霉素生物合成基因簇中结构基因和调剂基因的克隆和功能的确信也为合理化修饰力达霉素的生物合成途径和提高产量提供了可能性。力达霉素生物合成途径的分析显示B氨基酸结构单元上的C220H基团是在羟化酶SgcC催化下形

23、成的，通过基因敲除的方式将SgcC失活，取得了一种失去0H基团的新型力达霉素，该化合物不仅保留了原有的抗肿瘤活性，在没有辅基蛋白爱惜的条件下，25时稳固性比原化合物至少高出5倍以上5。6展望随着研究的不断开展，人们对力达霉素和烯二烘类抗生素的化学结构和生物活性有了愈来愈深切的了解，力达霉素对肿瘤细胞壮大的杀伤力使之有望成为抗癌的一种重要的化学医治手腕。目前，力达霉素的药理学研究己经进入I期临床。同时，力达霉素为医药工作者提供了进行基础和临床研究的宽广领域。只有完全弄清力达霉素杀伤肿瘤细胞的作用机制并尽可能减小其毒副作用才能使力达霉素普遍应用于临床成为可能。力达霉素的生物合成也是一个相当复杂的进

24、程,不但步骤繁多，还需要对代谢网络的和谐操纵，对生物合成途径的说明将有利于提高力达霉素产生菌的产量，并使力达霉素的结构改造变得简便易行。关于力达霉素生物合成途径的研究为咱们在基因和生化水平探讨天然产物的生物合成机制提供了一个极好的模型，对研究其它烯二块类抗生素的生物合成提供了极有价值的参考。相信随着研究的不断深切，力达霉素和烯二焕类抗生素在肿瘤的化学医治方面将会显示庞大的作用。参考文献1 HuJL,XueYC,XieMY,etal.Anewmacromolecularantitumorantibiotic,C1027.I.Discovery,taxonomyofproducingorganis

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