铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性

1、铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性 作者：贾鸣，胡晓梅，孙卫忠，饶贤才，丛延广，胡福泉 【摘要】 目的： 克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性. 方法： 应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因，将其克隆于原核表达载体pQE31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达；采用NiNTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白；提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖，观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性. 结果： 采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因，所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定

2、与设计序列一致；转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25；SDSPAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达. 经NiNTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95. 初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用. 结论： 重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础. 【关键词】 假单胞菌，铜绿；细菌噬菌体；多糖解聚酶；生物膜；胞外多糖；克隆，分子；蛋白表达 0引言 胞外多糖是细菌

3、生物膜的主要成分. 研究表明，噬菌体产生的多糖解聚酶在酶量充足的情况下可以破坏细菌生物膜的整个结构1，从而有可能成为专门破坏细菌生物膜的“酶学消解剂”. 在本室已完成全基因组测序和注释的铜绿假单胞菌噬菌体PaP32中，p02基因的编码产物被推定为多糖解聚酶家簇的成员，但这种推定需要实验的进一步证实. 本研究从噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因，并在此基础上建立原核表达和纯化的方法，获得了能够特异降解胞外多糖的重组多糖解聚酶，为深入研究PaP3多糖解聚酶基因的功能奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料表达质粒pQE31为Qiagen产品；大肠埃希菌JM109由本室保存；噬菌体PaP3由本室

4、分离自西南医院污水处理站，冻干后于4保存. 受体菌PA3由新桥医院检验科提供，本室保存. MullerHinton肉汤（MHB）和MullerHinton琼脂（MHA）购自北京天坛生物. 聚碳酸酯膜片购自Sigma公司. 限制性内切酶Hind, BamH购自NEB公司，Ex Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司,T4 DNA连接酶购自Promega公司，质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Omega公司. 1.2方法 1.2.1噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的扩增本室已完成对噬菌体PaP3的全基因组测序，基因组序列和注释已登录GenBank（AY078382）. 根据推定的噬菌体PaP3多

5、糖解聚酶基因的碱基序列，设计1对引物，上游引物的5端引入保护碱基（GCT）和BamH酶切位点，序列为：5GCTGGATCCGATGAAGTTCGACGAATAC 3；下游引物的5端引入保护碱基（GCG）和Hind酶切位点，序列为：5GCGAAGCTTGTTAAGT CACCGTGCTAC3. 引物由上海生工生物工程公司合成. 制备噬菌体PaP3颗粒，提取噬菌体DNA为模板，扩增PaP3多糖解聚酶基因. PCR扩增过程：50 L的反应体系中，上下游引物各2 L，dNTPs 混合物（每个2.5 mmol/L）1 L, 25 mmol/L MgCl2 4 L, Ex Taq酶0.3 L，PaP3模板

6、DNA 0.5 L，双蒸水35 L. 混匀后，按照以下的循环参数在PCR仪中进行反应：94预变性2 min,然后94 30 s55 30 s72 1 min进行25个循环，最后72延伸10 min. 反应结束后，电泳检测并回收. 1.2.2目的基因的克隆、转化及酶切鉴定PCR扩增产物和质粒pQE31经过10 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，分别回收500 bp和3400 bp的片段并纯化. 纯化后的PCR产物和pQE31质粒分别经过BamH， Hind酶切后，进行连接反应. 在20 L连接反应体系中，取4 L的PCR产物，加入pQE31载体质粒7 L，10×连接酶缓冲液2 L，T4 DNA

7、连接酶（5 U/L）1 L，双蒸水6 L，在16连接16 h. 取6 L连接产物转化感受态细胞JM109，用含有氨苄的LB琼脂平板筛选，37孵育18 h，挑取转化平板上的菌落增菌后提取质粒，并用BamH，Hind进行双酶切鉴定. 酶切鉴定无误的重组质粒送北京三搏远志公司进行核苷酸序列测定. 测序结果与GenBank公布序列通过BLAST软件进行比对分析. 1.2.3重组基因工程菌的诱导表达和纯化将鉴定好的基因工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37振摇培养至A600 nm约为0.6时加入IPTG诱导表达5 h，收菌进行SDSPAGE电泳. 凝胶扫描仪对电泳凝胶进行扫描，Quantity

8、One软件分析重组蛋白表达率. 收集诱导表达的重组菌，在冰浴中超声破菌，300 W，3 s，间歇2 s，全程30 min. 13 000 g离心1 h，收集上清和沉淀，SDSPAGE鉴定目的蛋白表达形式. 随后采用NiNTA纯化系统对目的蛋白进行亲和层析纯化，并将各步留取的样品作SDSPAGE电泳分析. 将纯化后的目的蛋白浓缩冻干，取冻干产物，用0.01 mol/L的PBS溶解. 用BCA法测定蛋白浓度后，分装并置于-20保存备用. 1.2.4重组噬菌体PaP3多糖解聚酶蛋白的活性检测根据文献3的方法提取生物膜的胞外多糖，取2.5 mL过夜培养的铜绿假单胞菌加入50 mL MHB 肉汤中，同时

9、加入灭菌聚碳酸酯膜片， 37孵育24 h，即得到已形成生物膜的膜片. 用PBS洗涤2次，去除表面的浮游菌细胞. 再加入50 mL PBS，120 r/min振摇1 min洗脱生物膜，10 000g离心20 min将细菌沉淀和生物膜多糖（上清）分离，用3倍体积的无水乙醇加入上清中以沉淀胞外多糖成分，将沉淀用无菌蒸馏水再次溶解，制成胞外多糖溶液，-20保存备用. 将提取的生物膜多糖加入到凝胶中（终浓度24 g/L），凝胶成分（300 g/L丙烯酰胺1.28 mL；1.5 mol/L Tris·HCl，pH 8.8 1.04 mL；100 g/L SDS 0.04 mL；100 g/L过硫

10、酸铵0.04 mL；TEMED 0.002 mL；胞外多糖 0.012 mL）凝胶厚度为1.5 mm，待凝胶凝固后取下备用. 用打孔器在凝胶上依次均匀打孔，然后将多糖解聚酶及PBS（阴性对照）各30 L样品依次加入到孔中，放置于湿盒中37孵育16 h. 加入染色液（0.1 g/L KOH，1 g/L亚甲基蓝）染色2 h，用双蒸水脱色后，观察结果. 2结果 2.1目的基因的扩增和克隆结果如图1所示，PCR扩增产物的大小约为500 bp（见6泳道），与预期大小相吻合. PCR纯化产物和pQE31质粒分别经BamH，Hind酶切纯化后，进行连接反应，连接产物转化受体菌JM109. 经过氨苄平板筛选后

11、增菌提取质粒. 经BamH，Hind双酶切后电泳检测，分别在3500 bp和500 bp左右可见到酶切片段（见1,2泳道），结果与理论预期值一致. 核苷酸测序结果表明，重组质粒的序列和阅读框均正确. 2.2重组工程菌的诱导表达对筛选到的阳性克隆增菌培养，并用IPTG诱导5 h后行SDSPAGE鉴定，结果如图2所示. 从图中第3泳道可见阳性重组子在分子量约20 ku处有一条表达蛋白带，此蛋白与理论预期的融合蛋白分子量大小相符，为序列正确的阳性重组子表达产物. 薄层扫描分析显示，目的蛋白表达量约为细菌总蛋白的25. 收集表达菌液，超声破菌. 在超声破菌的上清和沉淀中均有目的蛋白存在，并且主要存在于

12、上清中，说明目的蛋白主要以可溶形式表达. 12: 阳性重组质粒经BamHI/HindIII双酶切; 34: 阳性重组质粒;5: pQE31质粒对照;6: PaP3多糖解聚酶基因的PCR扩增产物;7: PaP3 DNA模板;M: DNA marker. 图1多糖解聚酶重组质粒及酶切鉴定 M: 低分子量蛋白marker; 1: pQE31空载体; 2: 阳性重组质粒; 3: 超声破菌沉淀; 4: 表达菌液上清; 5: 超声破菌上清. 图2重组PaP3多糖解聚酶的表达及表达形式鉴定 2.3目的蛋白的亲和层析纯化由于目的蛋白主要以可溶形式存在，故用收集的上清行非变性条件下的亲和层析，用分别含10, 2

13、0, 250 mmol/L浓度的咪唑洗脱缓冲液（pH 8.0）依次进行洗脱，在亲和层析的洗脱峰中含分子量约20 ku的目的蛋白，与PaP3多糖解聚酶的理论分子量相符. SDSPAGE电泳显示（图3），洗脱峰中目的蛋白纯度高，基本无杂蛋白的存在，说明采用非变性的亲和层析可以实现重组PaP3多糖解聚酶的一步纯化. 纯化后的目的蛋白经分子筛层析去除盐份和多余的咪唑，并用BCA法测定其浓度，低温冷冻干燥后，用0.01 mol/L PBS溶解，调整浓度为10 g/L,-20冻存. 2.4重组PaP3多糖解聚酶活性的初步鉴定活性鉴定的结果显示，在加入重组多糖解聚酶蛋白30 L的孔中，形成了直径约为1.5

14、cm的降解圈，而加入PBS（阴性对照）的孔中，无透明降解环的形成，说明多糖解聚酶蛋白对生物膜的胞外多糖具有降解活性，结果见图4. M: 低分子量蛋白marker; 1: pQE31空载体; 2: 阳性重组质粒; 3: 超声破菌上清样本; 4: 亲和层析穿过峰样本; 5: 亲和层析洗脱峰样本. 3讨论 细菌生物膜是指被自身产生的外部多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构群体4. 包被有生物膜的细菌称为被膜菌，而那些游离于生物膜之外独立生长的细菌称为“浮游菌”. 被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性、还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同5. 医学实践中，与细菌生物膜相关

15、的疾病被称为菌膜病. 菌膜病一旦发生，常反复发作，极难彻底治愈，这与被膜菌对药物的耐受性增强密切相关. 而胞外多糖被能阻止抗生素渗入生物膜内层菌细胞, 是细菌通过生物膜增强耐药性的主要机制之一. 因此，如果能够寻找到新的破坏细菌生物膜的措施，无疑对阻断细菌的致病作用以及提高其对药物的敏感性进而杀灭耐药菌都具有重要意义. 噬菌体是能够“吃”掉细菌的病毒6. 噬菌体要“吃”掉被膜菌，首先必须突破细菌表面的糖被，因此，噬菌体基因组中必然具有编码分解细菌胞外多糖的多糖解聚酶基因. 最近的研究表明，噬菌体的确能够产生多糖解聚酶特异地降解细菌多糖. 并且多糖解聚酶基因已在几个噬菌体中发现7-8. Won等

16、对噬菌体Ealh基因组中一个编码胞外多糖解聚酶的基因进行了克隆和表达，表达蛋白对宿主菌的胞外多糖具有降解活性9. Hughes等的研究结果表明噬菌体通过产生多糖解聚酶能够特异地降解细菌生物膜，并且只要酶量充足就能完全破坏整个生物膜的结构10. 铜绿假单胞菌胞外多糖聚合物的主要成分是藻酸盐，Geoffrey等的研究显示，噬菌体F116作用于其宿主菌铜绿假单胞菌NCIMB 10548的生物膜，能够降低藻酸盐的粘度进而杀灭生物膜内的细菌3. 本研究以pQE31质粒作为表达载体，对PaP3的多糖解聚酶基因进行了克隆和表达，表达的目的蛋白带有6×His标签小肽，采用NiNTA非变性亲和柱实现了

17、目的蛋白的一步纯化，纯化后的多糖解聚酶蛋白能够分解铜绿假单胞菌的胞外多糖成分. 实验结果一方面验证了噬菌体PaP3p02基因的功能，推动了PaP3功能基因组学的研究，另一方面也为我们深入研究PaP3多糖解聚酶的功能及临床应用前景奠定了基础.【参考文献】 1 Hughes KA, Sutherland IW, Clark J, et al. Bacteriophage and associated polysaccharide depolymerasesnovel tools for study of bacterial biofilmsJ. J Appl Microbiol, 1998,85(

18、3):583-590.2 Tan Y, Zhang K, Hu F, et al. Whole genome sequencing of a novel temperate bacteriophage of P. aeruginosa: evidence of tRNA gene mediating integration of the phage genome into the host bacterial chromosomeJ. Cell Microbiol, 2007,9(2):479-491.3 Geoffrey W, Stephen P, Cedric J, et al. Redu

19、ction in exopolysaccharide viscosity as an aid to bacteriophage penetration through Pseudomonas aeruginosa biofilmsJ. Appl Environ Microbiol, 2001,67(6):2746-2753.4 Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterrial biofilms common cause of persistent infectionsJ. Science, 1999, 284(5418):1318-1322.5 Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agentsJ. Nat Rev Drug Discov, 2003,2(2):114-122.6 Alisky J. Bacteriophages show promise as antimicrobial agentsJ. J Infect, 1998,36(1):5-15.7 Petter JG, Vimr ER. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage K1F ta