细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤

1、细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤传统观点通常是将心肌的缺血再灌注损伤分为3种类型,即心肌顿抑、再灌注性心律失常和心肌坏死，并且认为坏死是心肌细胞死亡的唯一方式。 随着分子心血管病学研究的不断发展，近年来证实心肌细胞还存在着另外一种死 亡方式一细胞凋亡(apoptosis),并且在心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程中 发挥着重要作用。本文拟就此方面的进展进行综述，旨在为探索心肌缺血再灌注 损伤的有效措施提供资料。一、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的实验依据虽然目前有多项研究显示缺血再灌注可诱发心肌细胞凋亡，但是关于凋亡是由心肌缺血性损伤所诱发还是由再灌注损伤所诱发的问题仍然存在有争议。 Kajstura

2、 等发现,在体大鼠心肌缺血23h后即可出现凋亡细胞,缺血 后凋亡 细胞的数量达到高峰，然后逐渐降低。采用在体大鼠心肌缺血再灌注模型发现 ， 持续缺血 或缺血45min后再灌注1h均有凋亡细胞的产生，并且随着再灌注时间 的延长,凋亡细胞的数目增加。与上述研究结果不同，采用在体家兔心肌缺血再灌 注模型发现,单纯缺血30min、和缺血5min再灌注4h的心肌细胞均未出现凋 亡现象,而缺血30min再灌注4h的心肌细胞则出现了凋亡，因此认为凋亡是心肌 对缺血再灌注损伤的一个特殊反应。Zhao等采用犬冠状动脉完全性梗阻7h或梗 阻1h后再灌注6h模型进行研究发现，尽管长时间缺血后可出现明显的心肌坏死，

3、但是原位TUNEL染色显示坏死区的凋亡细胞极少，而且缺乏特征性“ DNA梯状 条纹”。相比之下,缺血1h再灌注6h则可诱发凋亡细胞数目明显增加和出现典 型的特征性“ DNA梯状条纹”，而且凋亡细胞大多是出现在坏死心肌的周围区域 即缺血后血管再通的相关部位和梗死灶的收缩带区域。该研究结果提示，缺血再灌注后的心肌细胞凋亡主要是由再灌注过程诱发的。综合上述文献，目前认为长时间持续性缺血和再灌注均可诱发心肌细胞发生凋亡 ，尤其是再灌注后细胞内 ATP水平迅速恢复、胞浆和线粒体内钙超载以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性细胞凋亡的发生。二、心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的时程变化关系在缺血后再灌

4、注期间，心肌细胞的凋亡过程可分为几个阶段：再灌注 早期的起始阶段；中性粒细胞浸润的中间阶段；数天、数周或数月之后的延迟 阶段，该阶段可能与心室重塑和心功能衰竭的发生有关。对于心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的演变规律，目前同样存 在着较大的争议。Kajstura等采用在体大鼠心肌缺血模型研究发现,心肌缺血2h 后,凋亡细胞和坏死细胞同时出现；随着缺血时间延长，在凋亡细胞增多的同时亦 演变为坏死细胞。Zhao等采用犬心肌局部缺血1h再灌注6h、24h、48h或72h 模型研究发现，心肌坏死的程度在再灌注24h时最为严重，此后一直保持着相对 恒定的状态。相比之下，随着再灌注时间延长，凋亡细胞在

5、坏死组织周围区进行性 增多,至再灌注72h时达到高峰。这提示细胞坏死和细胞凋亡在再灌注期间可同 时发生,并且在再灌注早期坏死的发生率相对较高，而在再灌注后期凋亡的发生 率较高。三、细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用由于再灌注期间凋亡细胞主要是出现在坏死心肌的周围区域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用。为此，有人采用核酸内切酶抑制剂一金精三羧酸(ATA)分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死 中的作用。结果显示,在犬冠状动脉梗阻1h再灌注24h模型上,再灌注开始时采 用ATA处理可明显减少坏死组织周围区凋亡心肌细胞的数目,同时伴有特征性“DNA梯状条纹”的缺失。这种

6、凋亡程度的降低主要是与Bcl-2上调以及Bax和 细胞凋亡蛋白酶(Caspase-3)活性降低有关。更为重要的是,ATA所致的心肌凋亡 抑制可明显缩小心肌梗死的面积。采用小鼠心脏特异性细胞凋亡蛋白酶过度表达 模型的研究发现，在缺血后心肌细胞凋亡加重的同时，亦出现了心肌梗死面积的 扩大和心功能的恶化。这说明细胞凋亡和细胞坏死之间存在着一定的交叉和，因此抑制心肌细胞凋亡可能是临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤的一条重要 途径。四、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的信号转导通路目前认为,各种促凋亡的损伤因素一般是通过激活死亡受体 (death receptor, DR)依赖性信号转导通路和线粒体依赖性信号

7、转导通路诱发细胞凋亡。 死亡受体被其相应的促凋亡配体激活后，可导致凋亡调控基因(主要是Bcl-2家 族)表达失衡和胞浆蛋白酶(即Caspase家族)活化。而线粒体依赖性途径被激活 后,可诱发线粒体释放细胞色素 C(cyto C)和凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1),并 与半胱天冬酶9的前体形成复合物，激活下游的半胱天冬酶。半胱天冬酶是细胞 凋亡过程的执行器，通过上述两条途径激发半胱天冬酶家族的级联反应是细胞发 生凋亡的一个中心环节。(一) 由死亡受体介导的细胞凋亡肿瘤坏死因子(TNFa )、Fas配体(FasL)和TNF扌目关性凋亡诱导配体 (TRAIL)均可诱导细胞发生凋亡，因此被称为死

8、亡因子(death factor)。介导它们 诱导凋亡作用的受体被称之为死亡受体。位于细胞膜表面的死亡受体主要包括TNFR1亦称为 p55 或 CD120a） Fas（亦称为 CD95 或 Apol）、DR3 DR4 和 DR5,它们的共同特征是胞内部分有一大约 80个氨基酸残基构成的死亡功能域 （death domain,DD）。死亡因子可分别激活相应的受体，启动导致凋亡的信号转导 通路。激活的死亡受体可与细胞内的多种亦具有死亡功能域的受体接头蛋白相结 合。其中,激活的Fas和DR3可与Fas相关性死亡功能域（FADD）相结合，而激活 的TNFR和 DR4可与TNFF相关性死亡功能域（TRA

9、DD相结合。此外,通过TRADD和 FADD之间的相互作用，来自TNFR1的激活信号亦可与Fas信号转导通路发生。死亡受体激活后，可通过一系列反应激活胞浆内的胱门蛋白酶。一般认 为，胱门蛋白酶的活化是凋亡执行过程中的最后通路。胱门蛋白酶家族属于白介 素-1 B转化酶（ICE）类蛋白,因可在天冬氨酸残基之后将底物裂解,故目前被称 之为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶。根据胱门蛋白酶在细胞凋亡中的作用及其 N端的长度,可将其分为启动子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-8、9和10）和效应 子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-3、6和7,能被启动子胱门蛋白酶所激活）。在 正常情况下，胱门蛋白酶是以无活性的酶原形式存

10、在。在心肌缺血性损伤和再灌 注损伤的刺激下,Fas-FADD和TNFa -TRADD可诱导启动子胱门蛋白酶-8和10 的激活,然后酶解激活下游的效应子胱门蛋白酶-3、6和7而导致细胞凋亡。效 应子胱门蛋白酶（尤其是胱门蛋白酶-3）是细胞凋亡的执行器，活化后可裂解破坏 细胞的必需成分（例如细胞骨架和核蛋白）和抑制受损伤DNA的修复,从而诱发 细胞凋亡。研究显示，促凋亡配体与死亡受体结合后诱发细胞凋亡的反应可在数 小时内迅速发生,无须RNA或蛋白质合成,而且亦不依赖于线粒体11。也有研 究发现,死亡受体TNFR1被激活后还可进一步激活核转录因子k B（NF- k B）和丝裂素活化蛋白激酶（MAPK

11、）/c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK） 信号转导通路来调控心肌细胞凋亡，但是激活后的信号转导通路目前尚未被完全 阐明。（二）由线粒体损伤启动的细胞凋亡在死亡信号到达线粒体之后，首先引起线粒体膜通透性转运孔开放，然 后线粒体内外膜间的凋亡诱导蛋白被释放进入胞浆，主要包括cyto C、凋亡诱导因子（AIF）和半胱天冬酶-2、3、9的前体。在dATP的存在下,线粒体释放的cyto C可与Apaf-1形成三聚体。该复合体可将半胱天冬酶-9的前体直接裂解为线 粒体依赖性凋亡信号转导通路中最上游的半胱天冬酶11。随后,活化的半胱天冬酶-9可将半胱天冬酶-3的前

12、体裂解为半胱天冬酶-3。而AIF可通过直接激活 半胱天冬酶-3而诱发细胞凋亡。一般认为，凋亡的整个过程通常分为3个阶 段:决定死亡阶段：细胞表面的促凋亡信号与细胞内的抗凋亡信号发生联合,促使细胞作出生与死的决策；执行死亡阶段：如果细胞内的平衡状态倾向于凋亡，则可激活半胱天冬酶家族酶级联反应或AIF核转位而诱发DNA降解。残体清除阶段：包括邻近细胞对凋亡细胞的包围和吞噬消化。由于细胞发展成为不可逆 性凋亡的时间需数分钟至数小时或更长，所以在凋亡过程执行前可通过操纵有关 因素而影响结局。这就为损伤后治疗干预提供了一个“机会窗”，在这个机会窗内采用一定的措施挽救走向凋亡的心肌细胞，可起到心肌保护作用

13、12。（三）线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡中的相互关系线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡的过程中均具有重要作用，而且它 们之间可互相独立又可互相促进。总体来讲包括下列三种情况：C半胱天冬酶 直接诱导细胞凋亡，没有线粒体的参与，例如Fas诱导的凋亡;线粒体直接诱 导细胞凋亡,半胱天冬酶不参与。这种情况主要见于Bax或Bax类似蛋白大量表 达而抑制半胱天冬酶，使DNA发生凝集（而半胱天冬酶可使DNA发生降解）和线 粒体膜通透性转运孔开放；线粒体和半胱天冬酶共同参与细胞凋亡，以实现死 亡信号的级联放大，加快凋亡的发生11。目前,线粒体损伤和半胱天冬酶活化在缺血再灌注过程中诱发心肌细胞 凋亡的作用已经

14、得到了证实。采用培养的心肌细胞缺氧/复氧模型、在体大鼠局部心肌缺血再灌注模型以及氧化应激介导的犬心室功能障碍模型进行的研究均 发现,cyto C 释放以及半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9活化可诱发心肌细胞凋 亡。能够阻断cyto C释放和半胱天冬酶活化的药物和处理措施均可明显减轻心 肌细胞凋亡的程度,而加入外源性细胞色素C和dATP则可激活足以诱发心肌细 胞凋亡的半胱天冬酶6,11。而且,在原发性心肌病患者心肌中检测到的心肌凋 亡细胞亦可能是由线粒体cyto C释放所致的半胱天冬酶-3活化引起的。在犬 心肌缺血再灌注损伤模型的研究显示，缺血心肌内存在活化型半胱天冬酶-3的 高度表达,并且抑制半胱

15、天冬酶的活性可明显减轻心肌细胞凋亡的程度和缩小心 肌梗死的面积13。五、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生机制（一）心肌细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的调控基因分为诱导基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）。 在生理条件下,心肌细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因（Bax、Fas、p53等）和/ 或凋亡抑制基因（Bcl-2等）,共同调控细胞代谢而维持细胞内环境稳定。但是在 缺血再灌注过程中，凋亡相关基因及其表达产物发生了变化，从而导致心肌细胞 凋亡的发生。在调控凋亡的基因中，目前研究较多的是Bcl-2基因家族。Bcl-2 家族包括一组抗凋亡基因（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bag-1 和 B

16、I-1） 和一组促凋亡基因（Bax、Bak、Bad Bid和Bim）。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因， 而Bax的作用则正好相反，Bcl-2/Bax的比值将决定细胞是否发生凋亡。研究发 现,长时间缺血诱发心肌细胞发生凋亡之后,心肌内Bcl-2表达减少而Bax表达 增多14。据报道，在梗死区周围的存活心肌中有 Bcl-2的阳性表达，而在心肌 梗死区内则有Bax的过度表达。在Bcl-2过度表达的转基因小鼠,缺血和再灌注 所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死和心功能均明显减轻。通常认为Bcl-2具有抗氧化自由基的作用，可通过减轻脂质过氧化和 增强细胞对活性氧的耐受而预防凋亡的发生。另外，Bcl-2还可防止细

17、胞内酸中毒、抑制细胞内钙超载、抑制TNFa的合成和释放、减轻促凋亡基因Bax的细胞 毒性作用以及稳定线粒体膜电位和抑制线粒体释放cyto C和AIF等。这些作用均有助于减轻缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的发生14。（二）心肌细胞凋亡的外部诱发因素1. 中性粒细胞浸润研究发现，中性粒细胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌细胞凋亡的程度，并且危险区中性粒细胞聚集与凋亡细胞数目的增加呈 线性关系，提示中性粒细胞与心肌细胞凋亡的发生密切相关5,15。关于中性粒细胞如何介导心肌细胞凋亡的发生目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒细胞聚集堵塞微血管而导致无复流现象，亦可能与中性粒细胞活化后释放大量的炎性介 质（例

18、如自由基和细胞因子）有关16。2. 巨噬细胞活化采用离体和在体心肌缺血再灌注损伤模型的多项研究显示,巨噬细胞诱发的炎症反应可能是促发心肌细胞凋亡的重要因素16,17。离体实验研究显示，巨噬细胞可通过释放细胞因子和细胞毒性介质（例如TNFa和 NO而诱发细胞凋亡。在大鼠离体心肌细胞进行的研究发现，巨噬细胞释放的细胞 因子可呈时间依赖性诱导心肌细胞凋亡。近年来也还有研究发现，缺血再灌注心肌内的大部分巨噬细胞在再灌注 624h内一直维持着较为完整的形态，直到48h 后才发生明显的脱颗粒。再灌注 48h和72h后聚积在危险区内的巨噬细胞数和 凋亡细胞数呈明显的线性关系，提示活化的巨噬细胞可能参与了再灌

19、注诱发的延 迟性心肌细胞凋亡5,17。3. 非炎症细胞激活在心肌缺血再灌注过程中，除了上述炎症细胞之外， 被激活的血管内皮细胞和心肌细胞亦可合成和释放大量的炎症介质 ，然后通过死 亡受体依赖性信号转导通路而诱发心肌细胞凋亡 15。4. 氧化应激增强 多项研究显示，氧自由基是启动凋亡的重要因子，采用抗氧化剂和自由基清除剂可有效抑制细胞凋亡的发生。氧自由基诱发凋亡的机制可能为：氧化破坏内质和线粒体膜的完整性而导致细胞内钙超载；促使线粒体膜通透性转运孔开放而释放 cyto C;激活转录因子AP-1和NF-k B,后者可 通过上调TNFa和白介素-6而诱导心肌细胞凋亡的发生18。5. 细胞因子与黏附分

20、子大量表达在心肌缺血再灌注期间，活化的巨嗜 细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及心肌细胞本身可产生大量的细胞因子和黏附分 子。细胞因子不仅可促进心肌炎症，而且还可与黏附分子相互作用而加重心肌细 胞凋亡15。在缺血和再灌注期间,心肌细胞内的TNFa表达明显上调，TNFa可 通过下列机制诱发心肌细胞凋亡：与其受体TNFR1结合后,直接激活心肌细胞 凋亡的信号转导通路；激活酸性鞘磷脂酶，通过产生脂质信使神经酰胺而介导 细胞凋亡的发生；诱导内皮细胞和部分心肌细胞表达IL-1、IL-2、IL-6、细 胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血小板活化因子，促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附 和脱颗粒,并激活NADPH氧

21、化酶而释放氧自由基,从而间接地调控凋亡过程19。6. 细胞内钙超载 细胞内钙超载是各种损伤因素的最后共同通路。在缺 氧诱导的心肌细胞凋亡中,无论是阻断细胞外Ca2+内流还是减少细胞内Ca24释 放,均能有效减少心肌细胞凋亡的发生20。细胞内Ca2+浓度升高后可激活内源 性Ca2+-Mg2依赖性核酸内切酶，使细胞核内染色体DNA$解成寡核苷酸片段。 此外,Ca2+还可激活U型转谷酰胺酶，使大量蛋白质发生交联，在脂质膜下形成蛋 白质,防止胞浆内成分外漏，避免了像坏死所致的炎症反应。而且，转谷酰胺酶还 参与了胞浆膜的修饰，从而有利于吞噬细胞识别形成的凋亡小体而将其吞噬。7. 细胞内酸中毒在心肌缺血再

22、灌注时，无氧代谢可导致细胞内、外H+浓度增加而引起酸中毒。细胞内酸化可使细胞趋向凋亡，可能与凋亡过程中的一些酶例如核酸内切酶的最佳pH*有关15。8. 一氧化氮与细胞凋亡一氧化氮(nitric oxide,NO)是体内一种重要的生物信号分子，在心血管生理学和病理学过程中发挥着重要调节作用。研究发 现，NO具有细胞毒性作用，可增强氧化应激(尤其是iNOS的激活和过氧亚硝基阴 离子的大量生成)、干扰能量代谢、直接损害DNA激活多聚ADP核糖聚合酶PARP 或扰乱细胞内Ca2+稳态,从而诱导包括心肌细胞在内的多种细胞发生凋亡；但是亦有研究报道,NO是一种细胞保护因子，可通过抑制中性粒细胞的黏附和聚集、上调cGMP抑制9 Bcl-2降解和线粒体释放cyto C以及降低半胱天冬酶的活性而 抑制细胞凋亡的发生21,22。至于NO在心肌缺血再灌注过程中是发挥促进细 胞凋亡还是抑制细胞凋亡的作用，可能取决于NO在心脏内发挥作用的浓度和心 脏的氧化还原状态。六、缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的防治目前,防治心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡发生的措施包括：消除诱发细胞凋亡的因素、切断细胞凋亡信号转导途径