促衰变因子的研究进展

1、    关键词：促衰变因子 摘要近年来，国外对促衰变因子（DAF）的研究非常活跃。本文综述了DAF的分布及形成，生物化学、分子生物学表达调控及临床应用。相信不久的将来，在人类器官的移植中，DAF将发挥巨大的作用。 1969年，Haffmann报道了一种存在于人类红细胞基质提取物液相中的物质，它能抑制抗体包被的绵羊红细胞的补体介导的溶血；并且进一步证实了上述抑制包含了加速EAC14b2a到EAC14b的过程。80年代初，Nicholson-weller等通过用丁醇提取，采用连续色谱法，从豚鼠和人类红细胞基质中纯化了一种固有的膜糖蛋白；在纯化过程中，监测到它

2、能加速C3转化酶的衰变，从而命名为促衰变因子（decayacceleratingfactor,DAF）。用高碘酸Schiffs试剂染色，证实了人类DAF是一种糖蛋白。 1分布及存在形式 dAF广泛地分布于外周血细胞，包括红细胞、粒细胞、T和B淋巴细胞、单核细胞和血小板。DAF也存在于骨髓单个核细胞和红细胞系统的祖细胞上。Byrne等用转基因猪证实了DAF基因在异种基因启动子的调控下，可在包括心脏的脉管系统，肾脏及肝脏在内的各种器官中表达。Andoh等证实在炎性粘膜的肠道上皮细胞中也可检测到。Mizuno等认为正常人的结肠直肠粘膜及腺腔的上皮细胞上也存在。此外，DAF还可存在于膀胱、子宫、胸膜、

3、滑液浆膜的上皮细胞表面。培养的脐静脉内皮细胞上也存在。有趣的是自然杀伤细胞（NKC）上没有DAF。来自于外周血不同的细胞，其DAF分子量也不同；从放射免疫定量分析所见，不同细胞所含DAF分子个数也不尽相同。DAF的可溶性形式广泛存在于细胞外液及组织培养上清液中1，4。用二点免疫放射分析检测，DAF抗原在血浆、泪液、唾液、尿液、关节液和脑脊液（CSF）中均可检测到。免疫沉淀反应和Western印迹分析显示：来自不同液相中的DAF其分子量也略不同。采用同样的Western印迹分析，膜DAF分子的变异形式也在红细胞上检测到，这种较大的变异体取名为DAF-2；认为DAF-2是DAF的二聚体，虽然用2-

4、巯基乙醇还原或在SDS中变性都不能将DAF-2分解为2个组分。 2DAF基因及其调控 2.1DAF的cDNA的克隆形成及DAF基因1，5根据免疫亲和性纯化的红细胞DAF的氨基末端核苷酸探针技术，能克隆DAFcDNAs。克隆来源于由Hela上皮细胞株或HL-60早幼粒细胞白血病细胞系的m-RNA所组成的基因库，认为它是一个单一的、长的、开放性的、以蛋氨酸密码为起始位的读框，而以聚A尾巴作为结尾。在成熟蛋白的氨基末端起始部位，有4个毗邻的SCR（shortconsensusrepeat）单元，每单元有60个氨基酸。每个SCR含有4个半胱氨酸及脯氨酸、色氨酸、甘氨酸、酪氨酸及其它几种氨基酸残基。在体

5、内的其它补体调节蛋白如CR1，CR2，C4bp和H因子也发现了有与SCR同源的区域。SCR之后，是富含丝氨酸、苏氨酸共约70个氨基酸的区域；紧随其后的是羧基末端区，它是一个疏水性的、含24个氨基酸的片段，是结合磷脂酰肌醇的区域。用Southern印迹技术分析了人类的DAF，证实了DAF基因大约35kb长。DAF是一个单拷贝基因。用DAF特异的寡核苷酸探针杂交也支持这一点。通过杂交及原位杂交证实了编码DAF的基因位于人类第1号染色体长臂3区2带。 2.2膜DAF的糖基化磷脂锚定（GlycophospholipidanchorofmembraneDAF）当纯化的红细胞上的DAF被重新放回细胞混悬液

6、时，人们发现，DAF又再结合在细胞膜上。很明显，它是一种基本的膜蛋白，并且显示了功能活性。对DAF膜锚定区域的检测证实了DAF是近年来描述的一种典型的膜蛋白，它的羟基末端共价地结合在糖基化磷脂上，而糖基化磷脂内的磷脂酰肌醇嵌合在细胞膜的脂质双分子层的外层上。Davitz等第一次证实了上述锚定区域，并且证实了当外周血细胞被特异的磷脂酰肌醇磷脂酶（PI-PLC）作用时，细胞能释放DAF。而另一些研究者进一步证实用PI-PLC水解得到的DAF则失去DAF的疏水特性和它再结合到红细胞膜上的能力，并且不能抑制细胞膜上C3转化酶的形成。然而，DAF的亲水性形式仍能加速细胞膜上已形成的C4b2a的衰变，尽管

7、其功能减弱了。失去了糖基化磷脂契合区域的另一类DAF的亲水性片段，被证实在液相中降解C3转化酶的能力，与纯化的膜DAF的能力是等效的。因此认为DAF上的功能点不在糖基化磷脂锚定区域上。有学者证实了DAF蛋白质中羟基末端有氨基乙醇和葡萄糖胺及饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸复合物的存在。另外，薄层色谱的分析也显示了磷脂酰肌醇的存在。糖基化磷脂契合区域的可能功能如下1，4：作为一种工具，从细胞膜上释放蛋白质并且转导细胞内的信号。 2.3DAF基因表达的调控Andoh等研究了肿瘤坏死因子-（TNF）对3种肠道上皮细胞株的DAF基因表达的影响：DAFmRNA的表达是通过Northern印迹而检测的，DAF蛋白

8、表达是通过生物素标记的免疫沉淀反应而分析。结果发现：在HT29、T84和CaCo-2细胞中，TNF-导致了DAFmRNA和蛋白质表达有显著性加强。信使RNA稳定性研究认为TNF-以一种转录后机制部分地调节着DAF基因的表达。在人类肠道上皮细胞中，TNF-充当着DAFmRNA表达强有力的诱导物。Zarkakis6等认为DAF在人类滋养层的表达依赖于它们的解剖位置和妊娠时间。这种表达不仅依赖于细胞的分化阶段，并且cAMP是这种进程的细胞内的调节物。这种影响可以通过DAFmRNA的3-UT区进行调控。Kendall7等运用杂交分析和半定量的多聚酶链反应（PCR）技术，证实了神经生长因子（NGF）与D

9、AFmRNA的产生有关。 3DAF的生理学作用 一系列实验1，6，8证实了DAF是一种补体调节蛋白，能保护由于自家补体蛋白沉积于细胞表面而引起的细胞损伤。DAF能预防经典途径或旁路途径中C3和C5转化酶的形成，从而限制了补体级联中的放大步骤。初期DAF的纯化就是根据它能加速经典途径中已形成的C3转化酶和C4b2a衰变的能力。同时发现，当DAF没有影响到C4b或C3b结构的时候，DAF的抑制是可逆的。也有研究者认为DAF不能阻止C2或B结合到细胞上，但它能迅速地从C2a或Bb的结合部位降解C2a和Bb，从而防止了C3转化酶的形成。Kuttner9等用结构和功能同源的血清蛋白片段，H因子，建立起了

10、人类DAF的调节部位的模式。据此假设了加速C3转化酶衰变的机制。Shafren5等通过结合有DAF的柯萨奇病毒的研究，认为DAF可以作为一个低亲合性的受体，或者可增强病毒的表达，或者给病人提供一个隔离点，用于后来高亲和性的结合物去结合。 4DAF的临床应用 4.1在器官移植中应用超急性排斥反应阻碍了异种器官移植的临床应用，Pierson10及Pascher11等运用人类补体活化调节蛋白之一的DAF所产生的转基因猪提供了解决上述难题的一种有前途的途径。 pierson10等以转基因猪为研究对象，采用新鲜人血，运用ex-vivo肺灌注模式，发现存活者与肺部人类DAF表达和补体活化的免疫组化证据有关联的，从而证明转基因猪猪肺在器官移植中，得到了部分的生理学和组织学保护。Pascher11等采取同样的方式研究灌注人血后的转基因猪猪肝，证实非转基因猪猪肝有严重的器官损伤，而转基因猪猪肝中，通过免疫组化检测到了补体沉淀的存在，从而证明猪肝得到保护；可以证实，补体活化和C3及C4的消耗是相对较轻的。Byrne等证实了适当水平的DAF基因产物