梅毒检测技术规范(100808)

1、全国梅毒检测技术规范（试行讨论稿）中国疾病预防控制中心二。一。年八月精选、人 前言为了加强全国梅毒检测工作的管理，提高检测质量，根据中华人民共和国传染病防治法、 中国预防与控制梅毒规划(2010-2020 ) 的精神，在卫生部及中国疾病预防控制中心的领导下， 性病控制中心组织国内相关领域的专家制订了 全国梅毒检测技术规范 (下称 " 规范 " ) 。本“规范”是基于我国目前梅毒检测工作的需要以及梅毒检测技术的发展， 对梅毒检测相关的样品采集、检测方法、检测策略、质量管理等做出具体的规范要求，经上报卫生部并获准由中国疾病预防控制中心下发， 适用于全国各级医疗、 疾病预防控制、

2、妇幼保健、采供血、出入境检验检疫等提供梅毒检测服务的机构。本“规范”起草单位：中国疾病预防控制中心性病控制中心本“规范”参加编写单位：中国疾病预防控制中心艾滋病性病预防控制中心、中国疾病预防控制中心妇幼保健中心、 广东省皮肤性病控制中心、 江苏省疾病预防控制中心、天津疾病预防控制中心、上海市皮肤性病医院本“规范”参加编写及审核人员：尹跃平、王千秋、王宝玺、邢文革、王临红、郑和平、傅更峰傅更锋、顾伟鸣、郑钟洁、龚匡隆、陈祥生。本规范编写工作联系人：魏万慧本规范适用于全国所有的梅毒检测实验室。本规范解释权属于中国疾病预防控制中心。3第一章梅毒及其病原体第二章样品的采集和处理第三章梅毒血清学检测第四

3、章梅毒体病原学检测第五章梅毒核酸检测第六章实验室生物安全第七章梅毒血清学检测实验室质量管理第一章梅毒及其病原体梅毒是由梅毒苍白螺旋体（Treponema pallidum）引起的一种性传播疾病，可引起 神经、心血管等多系统损害，严重影响人群的身体健康。止匕外，梅毒亦可通过胎盘传 给胎儿，导致自发性流产、死产或先天梅毒等。20世纪80年代，梅毒在我国重新出现，90年代末以来，全国梅毒报告病例数明显增加，呈快速流行的趋势，已成为我 国重要的公共卫生问题。梅毒可分类为早期梅毒（一期、二期和早期隐性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期 隐性梅毒），许多梅毒患者的临床表现并不明显或者缺乏临床症状，病例的发现往往

4、 依赖于实验室的检测。梅毒的早期发现和及时治疗对有效预防和控制梅毒的流行具有 重要的意义，梅毒的检测是病例发现、临床诊断和疗效观察的重要手段。梅毒的检测方法不仅一直沿用许多传统的方法，而且，随着科学技术的发展，其 新的检测技术与方法不断出现并广泛应用。因此，规范各种检测方法、制定不同检测策略、加强质量控制和开展试剂评估等对确保梅毒临床服务和现场防治的质量具有重 要的意义。9第二章 样品的采集和处理1范围本章规定了用于梅毒检测的各类样品（包括血清、血浆、全血、皮损部位组织液、淋巴穿刺 液和脑脊液）的采集和处理方法，适用于梅毒血清学、病原学检测和核酸检测。2规范性引用文件梅毒诊断标准中华人民共和国

5、卫生行业标准WS 273-2007, 2007年性传播疾病实验室诊断指南中国疾病预防控制中心性病控制中心，2007年医疗机构临床实验室管理办法卫生部，卫医发200673号，2006年病原微生物实验室生物安全环境管理办法国家环境保护总局,2006年全国艾滋病检测技术规范中国疾病预防控制中心，2009年3样品种类及相应的用途3.1 血清、血浆、全血及脑脊液可用于梅毒血清学检测或核酸检测。3.2 皮损部位组织液、淋巴穿刺液可用于梅毒病原体检测或核酸检测。4操作步骤4.1 采样前准备4.1.1 根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采样技术规范的要求操作，遵

6、守生物安全要求。4.1.2 准备消毒用品、采样用具，包括采血管及试管架、钝刀（刮勺）、载玻片、 硬质废弃物容奥笺 04.1.3 选择合适的采样空间，受检者坐（卧）于合适的位置。4.1.4 根据样品编码的原则和方法，制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。4.1.5 使用样品记录本或登记表记录样品。4.2 采集和处理样品4.2.1 血液4.2.1.1 血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取静脉血，室温下自然放置12h,待血液凝固、血块收缩后再用15003000r/min离心15min,吸出上层血清，置于合适的容器中，备用。4.2.1.2 血浆：根据需要，用抗凝真空采血管抽取静脉血，15

7、003000r/min 离心15min,吸出上层血浆，置于合适的容器中，备用。4.2.1.3 末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。1 岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，收集滴出的血液，备用。4.2.2 皮损部位组织液4.2.2.1 用于病原学检查：用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压 皮损表层，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片。4.2.2.2 用于核酸检测：用无菌生理盐水浸湿的棉拭子榛去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮 损表面，取渗出液洗入细胞裂解缓冲液（1mL/管）的标本管中。4.2.3 淋巴穿刺液：无

8、菌操作下穿刺淋巴结，注入生理盐水并反复抽吸23次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片。4.2.4 脑脊液：采用腰椎穿刺术获得，应由相关专业人员操作。4.3 样品的保存4.3.1 如标本需要保存，采样前应对样品管或玻片进行核对并编码。要将标签贴在试管的侧面或玻片的一侧，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。4.3.2 血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于28C, 一周以上应存放于低于-20C的条件下。4.3.3 病原学检查用组织液、淋病淋巴穿刺液标本需要首先将标本涂于干净载玻片，然后使用固定液进行固定、自然干燥干燥后可置于28c下保存。4.3.4 核酸检测用组织液

9、、淋病淋巴穿刺液等标本均应置细胞裂解缓冲液后，放于一 70c冰箱中 保存。4.4 样品的运送4.4.1 应符合生物安全要求；获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。4.4.2 应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。4.4.2.1 第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的 标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材 料，以免碰碎。4.4.2.2 第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不

10、易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。4.4.2.3 第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。4.4.2.4 运送样品必须有记录。4.4.2.5 特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按三层包装，将样品管包扎好，严禁使用玻璃容器。4.5 样品的接收4.5.1 样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。4.5.2 核对样品与送检

11、单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。4.5.3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。4.5.4 接收样品时应填写样品接收单。第三章 梅毒血清学检测1范围本章规定了梅毒血清学的检测方法、程序、结果报告、检测策略及质量控制。2规范性引用文件梅毒诊断标准中华人民共和国卫生行业标准WS 273-2007, 2007年性传播疾病实验室诊断指南中国疾病预防控制中心性病控制中心，2007年Sexual

12、ly Transmitted Diseases Treatment Guidelines» 美国疾病预防控制中心，2006 年The use of rapid syphilis tests» WHO/TDR, 2006年3 实验室基本要求实验室建筑与设施应符合微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（中华人民共和国 卫生行业标准， WS 233-2002）中H二级生物安全防护实验室的规定，实验室人员应定期接受专 业培训，配备相应的设备（如水平旋转仪等），以满足梅毒实验室检测工作的需要。4检测目的与要点1.1 检测的目的1.1.1 梅毒血清学检测可用于临床诊断、血液筛查、流行病

13、学监测等。1.1.2 以临床诊断为目的的检测是为了确定梅毒感染的状况。1.1.3 以血液筛查为目的的检测是为了防止梅毒的经血传播。1.1.4 以流行病学监测为目的的检测是为了调查梅毒血清学感染率和发病率。1.2 检测要点1.2.1 根据目的选择检测方法及检测策略。1.2.4 可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。5 .检测方法分类梅毒血清学检测包括非梅毒螺旋体试验（非特异性梅毒抗体检测试验）和梅毒螺旋体试验（特异性梅毒抗体检测试验）两类方法。5.1 非梅毒螺旋体试验，包括快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST、性病研究实验室试验 （VDRL）等。5.2

14、 梅毒螺旋体试验，包括梅毒螺旋体颗粒凝集试验 （TPPA）、梅毒螺旋体血球凝集试验 （TPHA）、 梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）、化学发光试验、梅毒免疫层析法 -梅毒快速检测（TP-RT）、 FTA-ABS梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）和梅毒螺旋体蛋白印迹试验（ TP-WB等。6 .不同血清学检测方法及其所需的检测样品检测方法血清血浆末梢全血脑脊液非梅毒螺旋体试验快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）?甲笨胺红不加热血清试验（IRUS）?性病研究实验室试验 （VDRL）?梅毒螺旋体试验梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）?梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）?梅毒酶联免疫吸附试验（T

15、P-ELISA）?梅毒免疫层析法-梅毒快速检测（TP-RT）?荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）?化学发光免疫测定试验（CLIA）?梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）?梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB?7 .检测试剂所有应用于临床的检测试剂均必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中RPR TRUST TP-ELISA应有批批检合格证。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高 的试剂。8 .检测方法8.1 非特异性梅毒抗体检测非特异性梅毒抗体检测是以一定比例的心磷脂、卵磷脂及胆固醇混合物作为抗原，根据检测 目定性或定量检测梅毒患者血中的抗类脂抗原的抗体。8.1.1

16、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR -定性试验采用血清或血浆标本，置试验卡片的圆圈中，并均匀涂满整个圈内，在每个标本中准确地加1滴（17 L）抗原，将卡片置于水平旋转仪上旋转8min, 100± 2r/min ,立即在亮光下用肉眼观察结果。8.1.2 快速血浆反应素环状卡片试验（RPR -定量试验定量试验是将原血清或血浆标本先在卡片的圆圈中中进行对倍倍比稀释后，再按照定性试验的方法对每一个稀释度的标本进行检测和观察结果。8.1.3 甲苯胺红不加热血清试验（TRUST -定性和定量试验具体方法同RPRt性试验和RPRt量试验。8.1.4 性病研究实验室试验（VDRL -定性试验采用0.

17、05mL血清或脑脊液标本置入反应板圈中，将血清涂布到整个圈内，用标准针头加入1滴（17 L）抗原，并将反应板置水平旋转仪上旋转4min, 180±5r/min ,立即置低倍显微镜下观 察。8.1.5 性病研究实验室试验（VDRL -定量试验定量试验是将原血清或脑脊液标本先在反应圈中进行对倍稀释后，再按照定性试验的方法对每一个稀释度的标本进行检测和观察结果。 8.2 特异性梅毒抗体检测8.2.1 梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPATPPA试验是用超声裂解梅毒螺旋体抗原，致敏明胶粒子，其致敏粒子与待检血清或血浆中的抗梅毒螺旋体抗体结合， 产生肉眼可见的凝集，有效试验的阴性和阳性对照必须符合

18、试剂盒规定。 8.2.2梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHATPHA式验用超声裂解的梅毒螺旋体菌体为抗原致敏经醛化、糅化的羊或禽类红细胞，与待检血清或血浆中抗梅毒螺旋体抗体反应，产生肉眼可见的抗原抗体凝集，有效试验的阴性和阳性对 照必须符合试剂盒规定。8.2.3 梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）ELISA试验是用包被在固相板条上重组的梅毒螺旋体抗原，与待检血清或血浆标本中的梅毒 特异性抗体结合，再与酶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体反应，形成抗原抗体复合物而使底物 显色，用酶标仪测定结果。在试验中需要设立阳性和阴性对照，阳性和阴性对照结果必须符合试 剂盒要求。8.2.4 梅毒免疫层析法-梅毒

19、快速检测（TP-RT）TP-RT为免疫层析试验，简便快速，一般可在1030分钟内得出结果。以硝酸纤维膜为载体， 重组的梅毒螺旋体抗原抗原线状固定在膜上，待检样品（全血、血清或血浆）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。质控带显色为有效试验。8.2.5 荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）将待检血清用吸收剂 1:5稀释，阳性及阴性又照血清分别用PBS缓冲液和吸收剂1:5稀释，置37c湿盒内，30min；每次实验必须设 PBS缓冲液、吸收剂、PBS液1:5稀释的阳性和阴性对照血清、吸收剂1:5稀释的阳性和阴T对照血清共 6个对照涂片，每个涂片分别加入10 L稀释后的血清或

20、缓冲液，置 37c湿盒内，30分钟；用PBS-Tween-80液洗玻片2次，每次5min ,最后 用蒸储水洗一次，冷风干燥；每个涂片加10 L按要求稀释的荧光抗体，置37c湿盒内30min；用PBS- Tween-80液洗玻片2次，每次5min,最后用蒸储水洗一次，冷风干燥；用固定剂封片， 在荧光镜下观察荧光。8.2.6 化学发光试验（CLA）是用包被在固相板条上重组的梅毒螺旋体抗原，与待检血清或血浆标本中的梅毒特异性抗体结合采用发光底物，用发光仪测定结果。在试验中需要设立阳性和阴性对照，阳性和阴性对照结 果必须符合试剂盒要求。8.2.7 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB在每个反应槽中加 2

21、.0mL工作缓冲液，浸湿膜条 5分钟，加入0.02mL待检样本，置水平摇床上（50r/min） , 1825 c反应45min；弃去反应槽中液体，加入 2.0mL工作缓冲液，置水平摇 床洗涤三次，每次5min；加入酶标抗体，置水平摇床反应30min ;弃去反应槽中液体， 加入2.0mL 工作缓冲液，置水平摇床洗涤三次，每次5min ;每槽加2.0mL底物，置水平摇床上反应 810min；待阳性对照带显色清晰，加入1.0 mL终止剂2min后弃去槽中液体，用蒸储水洗2次，用镣子取出反应条，置滤纸上。根据阳性结果参比图谱判定结果。8.2.8 梅毒IgM抗体的检测（TP-IgM）测定IgM抗体方法的

22、基本原理是采用分离柱，使血清中的IgM和IgG按其分子量大小在分离过程中的沉降速度不同，将IgM和IgG分别收集，再进行 FTA-ABS等试验。亦可采用抗IgM单克隆抗体的酶标法、蛋白质印迹法等进行检测。9检测策略与流程9.1 以临床诊断为目的的检测策略9.1.1 检测策略：可采用两种策略：9.1.1.1 策略一：采用非梅毒螺旋体定性试验对样品进行初筛，对呈阴性反应的样品，可出具非 梅毒螺旋体试验阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，用梅毒螺旋体试验复检，对呈阴性反应 的样品，可出梅毒螺旋体试验阴性（-）报告；呈阳性反应的样品再进一步做非梅毒螺旋体定量试验，出具梅毒螺旋体试验和非梅毒螺旋体试验均

23、为阳性的报告，同时报告非梅毒螺旋体定量试 验滴度。出具报告时均需标明采用的具体方法。9.1.1.2 策略二：采用梅毒螺旋体试验初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具梅毒螺旋体试验 阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做非梅毒螺旋体定性试验进行复检，对呈阴 性反应的样品，可出具非梅毒螺旋体试验阴性（-）报告；呈阳性反应的样品再进一步做非梅毒螺旋体定量试验，出具梅毒螺旋体试验和非梅毒螺旋体试验均为阳性的报告，同时报告非梅毒螺 旋体定量试验滴度。出具报告时均需标明采用的具体方法。9.1.2 检测流程非 梅毒螺 旋体定 量试验非梅毒螺旋体试验（具体方法）报告检 测方法 及定量 结果图1:以临床

24、诊断为目的的检测策略一图2:以临床诊断为目的的检测策略二9.2 以血液筛查为目的的检测策略9.2.1 检测策略：采用高敏感的梅毒螺旋体试验（如 TP-ELISA方法）对样品进行筛检，出具梅毒 螺旋体试验阳性（+）或阴性（）结果，一般情况下，对阳性者不需要再采用非梅毒螺旋体试验 进行复检。9.2.2 检测流程图3:以血液筛查为目的的检测策略9.3 以流行病学监测为目的的检测策略9.3.1 检测策略：根据流行病学监测的目的选择不同的检测策略，包括评估梅毒血清学累计感染 率（梅毒螺旋体试验阳性率）、现患感染率（梅毒螺旋体试验和非梅毒螺旋体试验双阳性率）和 梅毒高滴度（梅毒螺旋体试验阳性及非梅毒螺旋体

25、定量试验滴度>1:8）感染率。9.3.1.1 用于估计累计感染率的策略： 采用梅毒螺旋体试验（如TP-ELISA）方法对样品进行检测， 报告梅毒螺旋体试验阳性（+）或阴性（）结果，阳性结果（+）者作为计算梅毒血清累计感染 率的分子。9.3.1.2 用于估计现症感染率的策略：采用梅毒螺旋体试验（如TP-ELISA）方法对样品进行初筛， 对呈阴性反应的样品，报告梅毒螺旋体试验阴性（）结果；对呈阳性反应的样品再用非梅毒螺旋体试验（如RPR TRUST方法进行定性检测，报告非梅毒螺旋体试验阳性（+）或阴性（）结果。梅毒螺旋体试验和非梅毒螺旋体定性试验结果均为阳性者作为计算梅毒血清现患感染率的 分

26、子。9.3.1.3 用于估计高滴度感染率的策略：采用梅毒螺旋体试验（如TP-ELISA）方法对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，报告梅毒螺旋体试验阴性（）结果；对呈阳性反应的样品再用一种非梅毒螺旋体试验（如RPR< TRUST方法进行定性检测。对非梅毒螺旋体试验呈阴性反应的样品，报告非梅毒螺旋体试验阴性（）结果；对呈阳性反应的样本再做定量（滴度）检测，报告非梅毒螺旋体试验滴度。梅毒螺旋体试验阳性和非梅毒螺旋体试验定量检测结果为大于1:8滴度者作为计算高滴度感染率的分子。 9.3.2检测流程10报告检测方法及阳性结果报告检测方法及阴性结果图4:以估计梅毒累计感染率为目的的检测策略图5:

27、以估计梅毒现症感染率为目的的检测策略19图6:以估计梅毒高滴度感染率为目的的检测策略10.质量控制10.1 血清学检测的非统计学室内质量控制非梅毒螺旋体试验的 RP书口 TRUST以及梅毒螺旋体试验的 TPPA TPHA TP-RT、TP-W曲均 采用肉眼直接阅读结果，其实内质量控制采用非统计学方法进行。10.1.1 试剂盒内部质控品对照试剂盒内部对照质控品即为试剂盒提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每个检测日，在检测样品前应先检测试剂盒内部 对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效，则表明此试剂盒失效。10.1.2 外部

28、质控品对照10.1.2.1 外部对照质控品，可采用商用质控品或自制质控品。质控品应包含阳性和阴性样品。非梅毒螺旋体试验阳性样品应有抗体滴度（一般为1:8 ）。自制质控品可使用本室保留的阳性样品。10.1.2.2 下列情况需做质量控制：更换试剂批号、更换检测人员、更换试剂厂家等。10.1.2.3 出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊（特别是产品名称或出产厂家名称， 批号和货号，失效期或/和生产日期）；泄漏或污染；置于过不适存放的条件；未达到质量控制标 准（阳性/阴性控制结果等标志）。10.1.2.4 除上

29、述情况以外，建议每个检测日检测一次阳性和阴性质控品。10.2 血清学检测的统计学室内质量控制梅毒螺旋体试验的 ELISA、CLA法等是通过临界值（Cut-off ）,判读结果，应采用统计学室 内质量控制10.2.1 试剂盒内部对照：试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时， 必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效， 必须重新试验。10.2.2 室内质控品：为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置

30、一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off ）的23倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的有效性，因此，每次实验必须 包含室内质控品，其结果无效，必须重新试验。室内质控品可以是商品或实验室自行制备。10.2.2.1 室内质控品的使用和质量要求：每一次实验必须使用室内质控品，以便监控实验的重复性。同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异。室内质控品的管间或瓶间变异必须小于监测 系统预期的变异（cv<20%）,并且质控品应稳定、无菌，且不含有影响试剂反应的防腐剂。10.2.2.2 统计室内质控的主要表示方法一建立质控图最常用的质控图是 Levey-Jennings 质控图，1

31、0.2.2.3 建立质控图参数外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于 4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到 20批次 数据后，替代临时性的均值和标准差。（1）算术平均值（x）：代表一组质控血清测定的s/co值的均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）所测得的外部对照质控血清S/CO值结果计算出平均值。（2）标准差（s）:是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与质控血清S/CO值均值有关的预期范围。一组 s

32、/co值的标准差以s表示。（3）变异系数（cv）:是反映各次 S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测 的重复性或精密度。（4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定。例如12S质控规则的控制限为外部质控品 S/CO均值加减2个标准差；13S质控规则的控制限为外部质控品 S/CO均值加 减3个标准差。10.2.2.4 绘制质控图质控图是把检测数据与已确定的（计算出的）“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和其上、下两条平行的控制线，并按时间顺序点入本实验室每批次试验质控血清的测定值。质控图绘 制步骤包括：（1）在常规条件下，对同一批血清连续测定 20次（

33、天）或以上，获得一组S/CO值，求均数（X） 和标准差（s）,超出2s或3s的数据不应删除。（2）将均值（x）和标准差（s）分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标（Y轴），每一批次试验作横座标（x轴），绘制质控图。（3）从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。8.1.3.3质控规则及其使用实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。（1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出x+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是 否可以继续检测需要进一步观

34、察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）:当外部质控品的 S/CO值超出x+3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品稳定性下降所致。（3）漂移：连续几次（35次）外部质控品的 S/CO值都落在均值的一侧则称为漂移，提示实验 条件发生了较大的变化。（4）趋势：连续几次（57次）外部质控品的 S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。质控规则的使用应检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低 的假失控概率。考察试验系统的可靠性应采用多规则质控方案，多规则质控

35、方法能提高误差检出，并具有低的假失控概率。其要点为：出现一次2s范围的变化时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。出现下列情况时，应暂停检测查找原因：（1）出现一次超出 3s范围的变化；（2）连续两次出现同一方向超出2s范围的变化；（3）连续四次出现同一方向的超出1s范围的变化；（4）连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。10.2.2.5质控图的分析及失控处理实验室应建立质控图分析及失控情况处理程序。当质控已有计划并恰当地执行时，要求可靠的均 值和标准差用于计算质控限，将假失控概率降到最低。当出现失控时，对原有外部质控品重复测 定或更换新的外部质控品进行测

36、定不是最有效的方法，必须找出问题发生的原因，找出解除问题 的方法，并消除原因，防止将来出现同样的问题。绘制和分析质控图的要点：（1）分析数据时，超出 2s或3s的数据不应删除。（2）由专人负责建立质控图，每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。(3)建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂，更换不同厂家的试剂后，须重新绘制质控图。改用新批号试剂如外部质控品测定出现较大变化也应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂，必须在质控图上注明使用日期。(4)发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。(5)使用新批次的外部质控品时，如测定值出现较大变化，须重新

37、绘制质控图。变异系数(cv)小于20%,表示外部质控品处于稳定状态。10.2.3室内质控其他方式一“即刻法”质控“即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。具体计算方法如下：10.2.3.1 将质控血清的测定值从小到大排列：x1,x2,x3xn (x1为最小值，xn为最大值)。10.2.3.2 计算 x 和 s。10.2.3.3 计算SI上限值和SI下限值。X最大值- SI上限二 sx -X最小值 SI下限二 s10.2.3.4 将SI上限、SI下限与SI值表(表1)中的数字比较。表1 SI值表Nn 3sn 2sNn3sn2s31.161.15122

38、.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.712.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56(1)当SI上限和SI下限n2s时表示处于控制范围内，可以继续测定。继续重复以上各项计算。(2)当SI上限和SI下限有一值处于n2sn3s值之间时说明该值在 2s3s范围，处于“告警”状态。(3)当SI上限和SI下限有一值n3s值时说明该值已在 3s范围之外，属“失控”。“即刻

39、法”只能在前 20次内使用，超出即可采用L-J质控图方法。10.3血清学检测室间质控开展梅毒血清学检测的实验室应参加各级性病防治机构或CDCfi织的实验室能力验证，能力验证实验应包括梅毒螺旋体试验以及非梅毒螺旋体试验的定性和定量两种检测方法。第四章梅毒病原学检测1范围本章规定了病原学检测的方法和用途。适用于对人皮损部位组织液、淋巴穿刺液的梅毒螺旋体检测。2规范性引用文件梅毒诊断标准中华人民共和国卫生行业标准WS 273-2007, 2007年性传播疾病实验室诊断指南中国疾病预防控制中心性病控制中心，2007年Sexually Transmitted Diseases Treatment Gui

40、delines» 美国疾病预防控制中心， 2006 年The use of rapid syphilis tests» WHO/TDR,200许3 实验室基本要求实验室建筑与设施应符合微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（中华人民共和国卫生行业标准， WS 233-2002）中H二级生物安全防护实验室的规定，实验室人员应定期接受专业培训，配备相应的设备（如暗视野显微镜等），以满足梅毒病原学检测的需要。实验室的质量保证和实验室安全防护按本规范相关章节规定执行。4检测目的对早期梅毒的硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液涂片、淋巴穿刺液涂片等，可在显微镜下观察梅毒螺旋体的特

41、殊形态和运动方式，判断是否存在梅毒螺旋体，用于梅毒感染的诊 断。5检测方法5.1 暗视野显微镜检查5.1.1 皮损部位组织液：无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮损表层，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片镜检，在暗视野显微镜下观察，寻找具有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。5.1.2 淋巴穿刺液：无菌操作下穿刺淋巴结，注入生理盐水并反复抽吸23次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片镜检，在暗视野显微镜下观察，寻找具有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。5. 2镀银染色检查基于梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染色，从而可以在镜下观察到银染的梅毒螺旋体。将

42、标本涂于干净载玻片作一薄片，于空气中自然干燥。用固定液将涂片固定23min。用无水酒 精洗涤玻片上的油污。加媒染剂于涂片上，微加热产生蒸汽，染 30sec。水洗，加银染液于涂片上，微加热产生蒸汽，染30sec。水洗、待干，用油镜检查。5.3 结果报告5.3.1 阳性5.3.1.1 暗视野显微镜检查：梅毒螺旋体为纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长520 ml直径小于0.2 m,有612个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等三种特征性的运动方式。暗视野显 微镜下观察到具有上述特征的螺旋体则报告阳性结果。5.3.1.2 镀银染色检查：显微镜下观察到染成棕褐色的梅毒螺旋体则报告阳性结果。5.3.2 阴性未见

43、到梅毒螺旋体，报告阴性结果。6质量控制检验人员应接受过梅毒螺旋体病原学检测的技术培训，以便正确地使用显微镜和识别梅毒螺旋体。第五章梅毒核酸检测1范围本章规定了梅毒螺旋体核酸定性检测的意义、实验室要求、检测方法、质量控制及结果判定等，适用于梅毒螺旋体核酸的测定。2规范性引用文件生殖道感染检测的实验室方法WHO , 1999年临床基因扩增诊断实验室工作规范卫生部，2002年临床基因扩增检验实验室管理暂行办法卫医发200210号，2002年全国艾滋病检测技术规范中国疾病预防控制中心，2009年3 核酸检测的意义对血浆、血清、皮损部位组织液、淋巴穿刺液及脑脊液等标本的梅毒螺旋体核酸检测，在早期梅毒、神

44、经梅毒和先天梅毒等诊断，以及螺旋体现症感染和既往感染鉴别诊断中具有一定的价 值。此外，核酸扩增技术也可应用于梅毒螺旋体的耐药性监测、菌株流行病学分型。4 实验室要求4.1 参照卫生部2002年颁发的临床基因扩增诊断实验室工作规范开展核酸检测工作4.2 实验室设置应参考卫生部2002年颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法中制定的临床基因扩增检验实验室基本设置标准。实验室应设置两个独立的工作区域：核酸扩增前区和 核酸扩增后区，前区包括试剂准备区和样品处理区，后区包括扩增区和扩增产物分析区，均应设 在不同的房间或区域。4.3 建立与实验和实验室管理相关的标准操作指导书和制定严格的管理制度，工作人

45、员必须充分了解各项规定并严格遵照执行。4.4 进行核酸检测的人员须具有核酸检测实验室的上岗资格。5检测方法及程序5.1 常规PCR核酸检测5.1.1 方法检测方法为商品化试剂盒和实验室自建方法，商品化试剂应严格按说明书操作。下面介绍的 方法是实验室自建方法，用于梅毒螺旋体常规检测、耐药基因检测或基因分型研究。5.1.2 试剂（1） PCR引物:梅毒螺旋体常规检测：一般使用扩增bmp tpp47、pol A等基因序列的引物。梅毒螺旋体耐药基因检测：目前已知阿奇霉素耐药基因采用23S ribosomal RNA（rRNA）gene等基因序列的引物。梅毒螺旋体基因分型研究：常用arp、tpr等基因序

46、列的引物。（2）主要试剂：包括核酸提取纯化、PC所需的试剂。5.1.3 检测程序5.1.3.1 核酸提取：可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。DNMZ置于-20 C保存，需长期保存的 DNMZ置于-80 C保存。5.1.3.2 PCR 扩增反应：PCR扩增反应体系包括四种脱氧核甘酸（dNTPs）、PC襟冲液、Taq DNA聚合酶、目的检测扩增引物（套式PCR包括内引物和外引物），根据不同检测目的使用相应的程序进行扩增。5.1.3.3 扩增产物分析：扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判 断扩增片段是否在预期的分子量范围内。

47、根据检测目的还可采用限制性内切酶酶切分析、特异性 探针杂交分析以及 DN际列分析等进行扩增产物分析。5.1.3.4 结果判定和报告每一次检测需同时做阳性对照、阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有 扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下视为实验成立，可作出核酸检测阳性或阴性结 果的判定。（1）核酸检测阳性：核酸扩增出现目的条带。（2）核酸检测阴性：核酸扩增未出现目的条带。6质量控制核酸扩增检测的质量控制应按照卫生部临床基因扩增检验实验室管理暂行办法进行，质量控制要考虑从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）

48、试剂；（5）操作过程；（6）外部质控品使用等。6.1 实验室环境检测实验室应严格要求不同工作区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产 物分析区，不能逆向流动。6.2 仪器设备加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次；PCR仪、离心机可以委托公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。6.3 检测过程严格执行仪器和试剂的标准操作程序（SOP,不得擅自修改。每次实验需同时使用试剂盒内的外部质控品；每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的外部质控品，并满足外部质 控品的要求。21第六章实验室生物安全1范围本章规定了梅毒检测实验室安全防护。适用于全国各级

49、各类梅毒实验室的安全防护。2规范性引用文件实验室生物安全通用要求GB 19489-2008 , 2009年微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS233-2002 ）中华人民共和国卫生行业标准，2003年消毒技术规范（2002年版）中华人民共和国卫生部，2003年全国艾滋病检测技术规范）中国疾病预防控制中心，2009年3梅毒的生物危害梅毒螺旋体属第三类病原微生物，一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风 险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，为具备有效治疗和预防措施的微生物。4梅毒相关检测的生物安全级别为了保证安全，对临床和现场的未知样本的检测梅毒血清学检测应在符合n级生物安全实

50、验室（BSL-2）要求的实验室中进行。如有艾滋病检测实验室，可以在艾滋病抗体检测实验室中进 行。5生物安全保证措施5.1 建立安全制度实验室主任是实验室安全的第一责任人，对实验室工作和环境的安全负责，负责制定全面的 实验室安全管理制度并监督落实。所有工作人员都应无条件遵守实验室安全管理制度，保护自己 和他人的安全。梅毒血清学检测实验室应建立实验室的安全工作制度或安全标准操作程序（S-SOP）,每年都应对安全制度或安全标准操作程序及其落实情况进行检查和修订，并有记录。5.2 培训和管理5.2.1 实验室应进行全员安全培训，所有的血液、未固定的组织和组织液样品，均应视为有潜 在的传染性，都应以安全

51、的方式进行操作。所有管理和检测人员都应接受省级以上梅毒、艾滋病 检测实验室主持的安全培训，包括上岗前培训和复训，并接受管理人员的监督。5.2.2 必须对新上岗人员进行安全教育和培训，使他们清楚实验室工作的潜在危险，通过考核 等方式确认他们具备安全操作的能力后方可单独工作。5.2.3 必须对新调入人员、外来合作、进修和学习的人员进行生物安全培训，经实验室主任批 准后，方可进入实验室。5.2.4 生物安全培训和监督应有客观详实的记录。5.3 个人保健和防护5.3.1 遇有手部皮肤有开放性伤口及其他不适于工作的情况，应暂停工作。5.3.2 应为每一名在梅毒实验室工作的人员提供充足的防护服、一次性乳胶

52、手套、口罩、帽子。应将清洁的防护服和其他个人防护用品置于实验室清洁区内的专用处存放。5.3.3 实验室应设置应急冲洗眼睛装置。5.3.4 工作人员上岗前必须进行梅毒、HIV抗体和乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒等肝炎病毒标志物检测，应接种乙肝疫苗。应每年对工作人员采血检测梅毒、HIV抗体，血清应长期保留。5.3.5 进实验室工作前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。5.3.6 严禁在实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。5.3.7 实验操作时应穿合适防护服（白大衣或一次性工作服）、戴手套和口罩、穿实验室专用的工作鞋。工作完毕，先脱去手套，再脱去防护服，用肥皂和流动水洗手。穿过的污染的防护服应

53、及时放入污物袋中，消毒后方可洗涤或废弃。操作过程中，如发现防护服被污染应立即更换，如手套破损，应立即丢弃、洗手并换上新手 套。5.3.8 禁止使用口腔吸液管，必须使用移液器来操作实验的所有液体。5.4 安全操作5.4.1 试剂及样品的管理应严格按要求妥善保存血清及其它体液样品，应按有关规定设立专门储存阳性血清、质控品 的血清库，应上锁并指定专人管理。5.4.2 实验室的清洁和消毒工作完毕应对工作台面消毒，推荐用 0.10.2%的次氯酸溶液消毒；用消毒液清洗后要干燥20min以上；操作过程中如有样品、检测试剂外溅，应及时消毒。5.4.3 样品的采集和处理抽取静脉血液（或以其它方式收集血液样品）时

54、要注意安全，应使用一次性注射器，戴手套,谨慎操作，防止血液污染双手。应小心防止被针头和其它利器刺伤。离心样品时要使用密闭的罐和密封头，防止离心时液体溢出或在超 /高速离心时形成气溶胶。5.4.4 样品的带入、带出和操作5.4.4.1 不得将非实验室物品带入实验室。5.4.4.2 打开样品容器时要小心，防止内容物泼溅。要核对样品与送检单，检查样品管有无破 损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器进行消毒，同时要按照程序 报告有关负责人。5.4.4.3 要检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如污染过重或者认为不能接受，则应将样品用安全方式废弃，同时将情况通知送样人。5.4.4.4 将样品转送到其他实验室时，应防止对工作人员、患者或环境造成污染。护送样品的 人应清楚接收地点和接收人，实验室负责人或其指定的人员应及时确认样品已送达指定的实验 室，被转入安全位置并得到妥善处理。5.4.4.5 被污染或可能污染的材料在带出实验室前应进行消毒。用后的包裹应进行消毒。5.5 使用利器注意事项5.5.1 应尽量避免在实验室使用针头、刀片、玻璃器皿等利器，以防刺伤。如果必须使用，在处理或清洗时应采取措施防止刺伤或划伤，并应对用过的物品进行消毒。5.5.2