化学文献及查阅方法

1、双水相萃取分离技术的研究摘要：双水相萃取技术是一种较新的生物分离技术，近年来发展较快，由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。双水相萃取技术的应用和发展日益受到重视。本文综述了双水相萃取技术的基本原理、特点、影响及应用，并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。关键词：双水相萃取；分离纯化；生物物质；前言：与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点1，已经越来越受到人们的重视。Beijeronck在189

2、6年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。双水相萃取（Aqueous two-phase extraction,ATPE）技术真正应用是在20世纪60年代，1956年瑞典轮的大学的Albertsson将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题2。1979年德国Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础3。迄今为止，被成功应用于生物医药工程，天然产物分离陈华，金属离子分离等方面4-6。因其广泛的应用性，已经发展成为一种相对成熟的技术，但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。一、双水相萃取原理7双水相

3、萃取与水有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示： K=C上/C下其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶

4、解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。二、双水相萃取技术的特点双水相萃取成为新兴生物技术产业研究的热点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势。双水相体系萃取技术具有如下特点：(1)双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高，相对于某些分离过程来说，能耗小，速度快。(2)含水量高(70 %90 %)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，会引起生物活性物质失活或变性；(3)分相时间短，自然分相时间一般为515min；(4)相体系的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离条件温和

5、，因而会保持绝大部分生物分子的活性，而且可直接用在发酵液中。如潘杰等人用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离、纯化8；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。Albertson证明了分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用有位有利；(7)易于进行连续化操作9，设备简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；(8)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体伤害很小以至基本无害；(9)影响双水相体系的因素比较复杂，从某种意义上说，可以采取多种手段来

6、提高选择性或提高收率；(10)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；(11)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的专一性。由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。三、影响双水相分离的主要因素10-11影响双水相萃取平衡的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的离子浓度、pH值、温度等。不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐糖<葡萄糖<羟丙基葡聚糖<甲基纤维素<聚乙二醇<聚丙三醇，这

7、种疏水性的差异对目的产物互作用是重要的。PEG分子量：同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加，这是由于分子链的长度增加，其所包含的羟基减少。两相亲水差距越大，其大小的选择性依赖于萃取过程的目的和方向。对于PEG聚合物，若想在上相收率较高，应降低平均分子量，若想在下相收率较高，则增加平均分子量。pH值：（1）pH值会影响蛋白质分子中可解离集团的解离程度，因而改变蛋白质所带的电荷的性质和大小，这是与蛋白质的等电点相关的；（2）pH值能改变盐的解离程度（如磷酸盐），进而改变时间电位差。萃取温度：温度首先影响相图，在临界点附近尤为明显。但当远离临界点时温度影响较小。大规模生产常在常温操作，但较高升温还

8、是有利于降温体系黏度，有利分相。无机盐浓度：盐的正、负离子在两相分配系数不同，两相间形成电位差，从而影响带电生物大分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两相间的电位差。四、双水相萃取技术的应用进展1.在生命科学中的应用传统的液液萃取分离，由于使用了有机溶剂，通常会使生物大分子（如蛋白质等）失活。而双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和，易操作，可调节因素多，目前已成功应用于生命科学中蛋白质、生物酶、细胞器、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分离纯化。双水相萃取技术在生命科学中的应用，国内外的研究都取得了很多丰富的成果。如Miyuki12通过PEG/ K3PO4双水相体系，用两步法对葡糖淀粉酶

9、进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG 1500 (第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。张志娟等13用PEG/磷酸盐双水相体系萃取青霉TS67胞外活性蛋白，研究了PEG的浓度、磷酸盐的浓度对蛋白的分配特性的影响。周念波等14采用PEG-(NH4)2SO4双水相体系直接从Bacillus spLS发酵液上清液中分离壳聚糖酶，确定了室温下双水相萃取最佳条件为：PEG 600 20、(NH4)2SO4 20、NaCl 0.1、pH值6.0，在此条件下壳聚糖酶分配系数达5.91，萃取率达

10、88.7。2.在天然药物提取与分离中的应用双水相萃取技术在天然药物提取与分离方面也有着独特的优势。在这方面的许多研究成果主要集中在国内。如朱自强等15用8%的PEG 2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相系统提取青霉素G，分配系数高达58.39，浓缩倍数为3.53，回收率为93.67%。霍清16分别研究了葛根素在PEG/(NH4)2SO4双水相体系与丙酮/K2HPO4双水相体中的分配特性，实验确定了PEG/(NH4)2SO4双水相最佳体系：PEG 1500质量分数20，(NH4)2SO4质量分数16，最大的分配系数可达148.2，最大收率99.09；丙酮/ K2HPO4双水相最佳体系

11、为：丙酮:水=8:2，K2HPO4质量为1.5g，最大的分配系数可达36.7，最大收率99.55。刑健敏等17研究了聚乙二醇/盐双水相体系中烟碱的分配行为，确定了当含盐量25%、pH=9为体系的最佳分离萃取条件，回收率为96.7%，纯度为99.87%。3.在金属分离及络合物中的应用双水相还可用于稀有金属/贵金属分离，传统的溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。据报道，在丙醇-硫酸铵双水相萃取体系中，实现了从大量基体金属如Fe2、Ca2、Mg2、Mn2、Al3、Pb2和Zn2中分离Pd()，萃取率可达9

12、9218。在溴化十六烷基吡啶一双水相体系中，实现了能够使Bi()与Mn()、Fe()、Co()、Ni()、Zn()、Al()等常见离子完全分离19；在丙醇-硫酸铵-碘化钾双水相体系中，实现了Au()的分离，获得了最佳萃取条件：HCl浓度0.6mol/L，(NH4)2SO4用量6.0g，KI浓度0.1mol/L，在最佳萃取条件下，体系对Au的平均萃取率为98.620。五、双水相技术的发展趋势211.廉价新型双水相系统的开发目前双水相萃取技术走向工业化所需解决的最大问题是构成双水相成相系统组分的价格十分昂贵。为了解决这个问题，国内外进行了大量的研究，一方面用廉价的无机盐代替以往常用的昂贵的葡聚糖。

13、硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐与PEG形成的双水相系统现已经大量用于萃取操作；另一方面开发可替代聚乙二醇和葡聚糖的高聚物。变性淀粉PPT、阿拉伯树胶、Pulluan的微生物多糖、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖，乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟基纤维素等替代PEG，均取得阶段性的成果。此外，有利用临界胶束浓度下表面活性剂的特异自组织行为及良好的稳定性形成的ATPS，此类ATPS分相依据的是胶束的形成，包括由非离子型表面活性剂组成的ATPS和由离子型表面活性剂组成的ATPS。这些由表面活性剂组成的ATPS与传统ATPS相比有含水量更高，两相更容易分离，表面活性

14、剂用量很少且可循环利用等独特的优点。2.亲和双水相萃取技术亲和吸附具有专一性强，分离效率高等特点。利用其特点，将亲和吸附与双水相萃取技术相结合，即对成相聚合物进行化学修饰。该体系不仅具有萃取系统处理量大、放大简单等优点，而且具有亲和吸附专一性强、分离效率高的特点。3.生物转化与双水相萃取技术相结合在生物转化过程中，随着转化的产物量的增加，常会抑制生化过程的进行。因此，及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。将双水相系统与生物转化相结合，形成双水相生物转化，解决了生物转化过程中存在的产物抑制以及生物催化剂回收利用两方面的问题，为生物转化赋予了新的内涵。4.双水相萃取与膜分离相结合利用中空纤维膜传

15、质面积大的特点，将膜分离与双水相萃取相结合，可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相体系隔开，可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面的吸附问题。因此，将膜分离同双水相萃取技术相结合，是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有利手段。5.双水相萃取与细胞破碎过程相结合利用高速珠磨机为设备，将细胞破碎和双水相萃取同时在珠磨机内进行。由于珠磨机内有良好的混合条件，PEG、无机盐和水得到充分混合，形成均匀的双水相分散体系。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相，细胞碎片分配在下相，胞内产物分配在上相。这种方法不仅节省了萃取设备和时间，而且由于双水相对很多蛋白质具有保持活性的特点，可以避免胞内产物的

16、损失。此外，国内外又相继开展了微重力双水相萃取、高速逆流双水相分配、双水相电萃取、温度诱导相分离双水相萃取等新技术的研究。六、双水相萃取技术的局限和未来展望22目前，双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯，并显示出众多其它分离技术不具备的优点，是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是，要将这一技术开发应用到大规模生产过程，还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。主要表现在如下几个方面。(1)聚合物/聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能，但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵，对于一般的生物产品，分离成本过高，从经济上是不合理的。(2)虽然通过选择适宜的双水相体系和操

17、作条件，可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数，但目标产物与成相物质的分离比较困难。(3)双水相体系界面张力较小，虽有利于提高传质效率，但是较小的界面张力会易导致乳化现象的产生，使相分离时间延长，分离效率降低。(4)双水相体系中组分间的作用非常复杂，目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。(5)缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究，在体系流体力学，相际间的传质，传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法，研究的结果只是建立在实验的基础上，大部分情况下不能外延，缺乏对过程规律的认识。(6)对双水相

18、萃取工艺整体的集成优化研究还不足，对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液，还没有找到一条科学合理的利用及处理途径，大量含盐或含成相组分的废水溶液难于回收及处理。虽然双水相萃取技术研究中还存在很多问题，但随着对双水相体系研究的不断深入，性能优良的新型成相物质不断发现以及相关技术的不断发展，这些方面的问题将会逐步获得解决。随着双水相萃取技术的不断完善,双水相萃取技术将成为一种生物活性物质分离提纯的重要技术方法。七、参考文献1 Josefine Persson, Hans-Olof Johansson, et al. Aqueous polymer two-phase systems fromed

19、 by new thermoseparating polymersJ. Bioseparation, 2000,(9):105-116.2 Anita Jain,B.N. Johri. Partitioning of an extracellular xylanae produced by a thermophilic fungus Melanocarpus albomyces IIS-68 in an aqueous two-phase systemJ.Bioresource Technology,1999,67:205-207.3 Gerben M Zijlstra, Cornelis D

20、 de Gooijer, Johannes Tramper. Extractive bioconversions in aqueous two-phase systemsJ, Current Opinion in Biotechnology,1998,(9): 171-176.4 Armando Venancio, Catarina Almeida, JoseA. Teixerira. Enzyme purification with aqueous two-phase systems comparison between systems composed of pure polymers a

21、nd systems composed of crude polymersJ.Journal of Chromatography B,1996, 680:131-136.5 B. A. Andrews, J. A. Asenjo. Protein partitioning equilibfrium between the aqueous poly(ethylene glycol) and salt phases and the solid protein phase in poly(ethylene glycol)-salt two-phase systemsJ. Journal of Chr

22、omatography B,1996, 685: 15-20.6 Laura Bulgariu, Dumitru Bulgariu. Extraction of mealions in aqueous polyethylene glycol-inorganic salt two-phase systems in the presence of inorganic extractants: Correlation between extraction behaviourand stability constants of extracted speciecJ. Journal of Chroma

23、tography A, 2008,(1196-1197): 117-124.7 徐长波,王巍杰. 双水相萃取技术研究进展J. 化工科技, 2009,17(2):75-79.8 潘杰，秦德华，高红等。全发酵液萃取丙酰螺旋霉素的研究中国医药工业杂志1998.29(12):534-537.9 李伟，朱自强，梅乐和。双水相萃取技术在药物分离和提取中的应用J .化工进展.1998.1：26-291.10 郭宪厚. 双水相萃取技术研究进展J. 广州化工，2009,36(5): 17-20.11 戴猷元. 新型萃取分离技术的发展及应用M.北京:化工工业出版社，2007.161-168.12 Miyuki M N, Kilikian B V. Separation an purification of glucoamylase in aqueous two-phase systems by a