流行性感冒诊断标准及处理原则

1、流行性感冒诊断标准及处理庭B159941995前言流行性感冒简称流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,主要通过空气飞沫传播.流感病毒有甲、乙、丙三个型,其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重,乙型常引起爆发,丙型那么多引起小儿散发病型.在我国虽将该病归属于法定丙类传染病,但一旦流行,传播快、涉及面广,对人民健康及劳动生产力有很大影响,而且对年老体弱多病者及婴幼儿的威胁较大.为贯彻执行?中华人民共和国传染病防治法?及?中华人民共和国传染病防治法实施方法?,特制定本标准.本标准的附录A是标准的附录；本标准的附录B、附录C都是提示的附录.本标准由中华人民共和国卫生部提出.本标准起草单位：中国预防医

2、学科学院病毒学研究所.本标准主要起草人：陶三菊.本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督治理办公室负责解释.1范围本标准规定了流感的诊断标准及处理原那么.本标准适用于各级各类医疗、卫生、保健机构和人员对流感的诊断、报告和处理的应用.2诊断原那么1/18流感流行时一般根据临床病症、结合流行病学可对病人作出初步诊断.如确定诊断那么需要别离病毒阳性或病人双份血清抗体,测定恢复期抗体较急性期增高4倍或以上.3诊断标准3.1流行病学史在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊上呼吸道感染病人明显增多.3.2临床病症3.2.

3、1出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、全身酸痛、乏力等中毒病症.3.2.2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕、流泪等呼吸道病症.3.2.3少数病例有食欲减退,伴有腹痛、腹胀、呕吐和腹泻等消化道病症.3.3实验室诊断3.3.1血液化验检查白细胞总数不高或偏低.3.3.2从病人鼻咽分泌物别离到流感病毒见附录Ao3.3.3恢复期病人血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期有4倍或4倍以上升高见附录Bo3.3.4直接检查呼吸道上皮细胞的流感病毒抗原阳性见附录C中C1.3.3.5标本经敏感细胞增殖1代后查抗原阳性见附录C中C2.2/183.4病例分类3.4.1疑似病例具备3.1加3.2或3.1加3.2加3.3.1.3.4.2

4、确诊病例疑似病例加3.3.2或3.3.3或3.3.4或3.3.5.4处理原那么4.1早期隔离病人、对症治疗病人和防治合并症早期发现病人、早期隔离病人是最重要的举措.对病人治疗一般采用对症治疗.防治并发症主要应预防流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,特别是对年老体弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或婴幼儿,流感本身或其合并症可能引起死亡,应特别注意增强治疗护理.4.2预防举措一般采用综合性预防举措,讲究卫生,注意体格锻炼和营养,保持室内空气流通；对易感人群应采取相对隔离举措,如预防接触病人,不去公共场所等；对年老体弱者必要时可采用灭活疫苗接种或服用金刚烷胺等预防方法但须注意金刚烷胺仅对防治甲型流感有效.

5、附录A标准的附录病原学诊断方法3/18A1病毒别离从疑似流感病人呼吸道采集标本别离病原体.A2标本的收集和处理A2.1标本收集时间应于发病早期13d内越早越好.A2.2标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法.棉拭子擦抹法用于采集儿童标本,采集时将灭菌棉拭子稍沾标本收集液pH7.27.6含20%40%灭菌肉汤的生理盐水或Hanks液或生理盐水,反复擦拭患者咽部数次,然后将此棉拭子放进装有上述收集液的试管中塞上棉塞.咽喉洗漱法用于采集成人标本,采集时先让患者咳嗽,然后用10mL左右的收集液反复洗漱咽喉部约1min,吐入管内.如有条件,儿童标本用负压抽吸法抽取鼻咽分泌物,成人标本用鼻咽洗液,可提升

6、别离的阳性率.标本采集后置冰壶4C中尽快送实验室.A2.3标本的处理：用毛细吸管反复吹打标本液如为咽拭子标本,先反复挤压咽拭子后弃之,将粘液打散,于4c静置510min,待自然沉淀后取3mLi清,按每毫升加青霉素1000单位和链霉素1000以g,混匀置4c处理24h即可接种.如标本污染较重,可置4c过夜处理.如预计标本在48h内不能完成接种时,应将标本置低温最好-70C保存.A3接种及培养法最常用鸡胚培养法和组织培养法,有条件的亦可同时用两种方法4/18进行病毒别离.A3.1鸡胚培养法： 取911日龄鸡胚,将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种0.2mL,每份标本接种34只胚,置3335c温箱

7、培养3d,然后将鸡胚放置4c冰箱过夜或置一20C冰箱1h再置4c数小时可分别收获尿液和羊水,并作初步血凝其方法是用毛细吸管取12滴尿液或羊水,置大孔塑料板内,再参加12滴1%鸡红细胞,摇匀后置室温或4C3045min观察结果,根据血球凝集程度的不同可分为HIIP、HIP、HP、+、一,如血凝为HIIHIIP时,再按系列倍比稀释测定其血凝滴度,如具有一定血凝滴度即可鉴定.如血凝阴性,可盲传2代,如仍为阴性那么弃之.A3.2组织培养法：用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾或猴肾或地鼠肾,或狗肾传代细胞MadinDarbyCanineKidney,MDCK每份标本接种4管,置37c吸

8、附12h后弃标本液,再参加每毫升含2以g胰酶的199维持液1mL于33c培养710d,并逐日观察病变.从第三天开始每隔一天用0.4%鸡或豚鼠红细胞对培养管做红细胞吸附试验试验前无菌法收获细胞培养上清液 ,如阴性那么用已收获的上清液盲目传代,如阳性那么测定上清液的血凝滴度.如标本第1代红细胞吸附试验阴性,可用收获的全部上清液混合进行盲传2代,仍为阴性那么弃OA4新别离株的鉴定5/18新别离流感病毒可用血凝抑制、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定.最常用和最简单的方法是血凝抑制试验,必要时采用补体结合试验.A4.1血凝抑制试验：用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与

9、新别离流感病毒做血凝抑制试验,观察新分离株能否被免疫血清所抑制.血凝抑制试验方法见附录BoA4.2红细胞吸附抑制试验：取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管,用Hanks液洗细胞2次,参加经霍乱滤液RDE处理1：10的免疫血清0.2mL,再参加Hanks0.6mL,室温作用30min后,再参加0.4%鸡或豚鼠红细胞0.2mL,置室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附.如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制,说明所别离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近.A4.3补体结合试验：如果用的甲型甲3、甲1或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新别离病毒的血凝均不能抑制,那么应考虑可能为甲型流

10、感病毒的新亚型,可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型.附录B提示的附录血清学诊断方法6/18B1血凝抑制试验方法81.1原理一些动物红细胞如鸡、豚鼠等以及人O型血红细胞上有流感病毒受体,遇流感病毒可产生红细胞凝集现象,简称血凝.假设将特异性抗体与流感病毒血凝素预先作用后再参加红细胞那么不产生凝集,称为血凝抑制现象.用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后,能完全抑制血凝的最高稀释度,即为血凝抑制抗体效价.81.2主要材料大孔塑料板,1mL吸管或1mL移液器.81.3双份血清收集及处理急性期血清于发病3d内采取,恢复期血清于发病后24周采取.取0.1mL已别离的血清参加0.

11、9或0.4mL霍乱滤液RDE即1：10或1：5稀释 摇匀,于37c水浴中过夜,以去除血清中的非特异性抑制素,次日置56c水浴50min以灭活多余的RDEB1.4流感病毒血凝素制备流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液,参加1/10000硫柳汞防腐.为了延迟尿盐沉淀可先用无菌生理盐水做等量稀释,置4C备用.81.5鸡红细胞悬液的制备从静脉或心脏抽取正常健康鸡血,保存于阿氏Alsevr/s液中,置4c保存.用前以生理盐水洗3次,末次经2000r/min离心7/1810min,将红细胞用生理盐水配成1%浓度.81.6血凝素滴定将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1:5开始做系列倍比稀释,每孔0.

12、25mL再参加等量1%鸡红细胞,摇匀,置室温或4c3045min后观察结果,以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价,即为1个血凝单位,实验时采用4个血凝素单位,例如血凝素效价为1：320,为1个单位,4个单位即为1： 80稀释.正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验.81.7血凝抑制试验步骤81.7.1将上述已处理的待检血清1：10或1：5再用生理盐水做系列倍比稀释,每孔加0.25mL.81.7.2参加等量已配好的4个单位血凝素.81.7.3每孔参加0.25mL1%鸡红细胞,摇匀置室温或4c3045min.81.8结果观察观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟,待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时

13、读结果.以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价.在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行,并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性.B2型特异性补体结合试验82.1原理8/18甲、乙、丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原核蛋白抗原 ,甲型流感病毒各亚型均具有相同的可溶性抗原,与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同,因此可利用补体结合试验来区别它们.当流感病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时,由于来不及充分掌握新别离毒株的性状,常需同时采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行血清学诊断.82.2型特异免疫血清制备82.2.1免疫用抗原甲型为PR8株和乙型为L

14、ee株均为小鼠适应株.于乙醴麻醉下鼻腔感染1216g小鼠,每鼠0.05mL,待感染后35d大局部小鼠发病、局部死亡时,解剖小鼠.取肺研磨并用生理盐水制成10%的悬液,低速离心去除粗块,取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原.82.2.2免疫血清制备选体重300500g的健康豚鼠,免前采血35mL别离血清分装冻存留作对照.豚鼠用乙醴轻度麻醉,鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原0.5mL,共免疫34次,每次间隔一周,在末次免疫的同时,由腹腔注射鼠肺悬液2mL一周后试血,如果对同型尿膜抗原的血清效价超过1： 80,而与异型抗原无交叉反响,立即采血别离血清分装冻存于低温-20C以下.试验前血清于56c水浴灭活30min.

15、82.3可溶性抗原的制备9/18用甲、乙型流感病毒或新别离病毒按常规接种和收获尿铤液,如尿液血凝在1：40以上时,收获其尿铤膜,将尿铤膜用盐水洗一次,用无菌剪刀将膜剪成数小块放入试管中,每个鸡胚的尿铤膜加1mL无菌生理盐水,冻化三次,末次化后以3000r/min离心15min,吸出上清即为可溶性抗原,参加1：10000的硫柳汞防腐,置4c冰箱至少可用一个月.82.4双份血清采集收集病人急性期发病3d内和恢复期发病1030d后的血清.血清于试验前56C30min灭活.82.5 1%绵羊红细胞悬液制备、溶血素、补体的制备和滴定按常规方法.82.6补体结合试验步骤按常规进行.82.7结果判定82.7

16、.1被检病毒尿膜抗原与甲型或乙型流感病毒免疫血清呈阳性反响那么可诊断为甲型或乙型流感病毒,如甲、乙均为阴性时,应考虑丙型流感病毒或其他病毒.82.7.2双份血清对甲型或乙型抗原有4倍或4倍以上升高,即可诊断为甲型或乙型流感病毒感染.82.7.3正常人群补体结合抗体滴度一般在1：16以下,如单份恢复期血清抗体在1:32以上时,结合临床病症可作诊断的参考.10/1882.7.4人群血清抗体水平调查中,补体结合抗体在1：32以上者可作为新近感染流感的证据.B3神经氨酸酶抑制试验83.1原理胎球蛋白Fetuin底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后,使N乙酰神经氨酸游离出来,经过碘酸盐的氧化作用将N乙酰神经

17、氨酸转化为B甲醛内酮酸,后者经硫代巴比妥酸作用形成生色团,用有机溶剂提取生色团,并在分光光度计上比色.利用上述反响可测知流感病毒的神经氨酸酶活性,反响的颜色越深酶活性越强.并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量.神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂量的神经氨酸酶即一定稀释度的流感病毒尿囊液和系列稀释的被检血清和正常血清起孵育,测知血清作用于神经氨酸酶活性的抑制效价,并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度.83.2器材及试剂83.2.1小试管、10mL吸管及分光光度计等.83.2.2磷酸缓冲液PBSpH5.9及生理盐水.83.2.3胎球蛋白底物液：450500mg冰冻枯燥的胎球蛋白加蒸储水10mL溶解后置

18、4c保存,每周新配.83.2.4过碘酸钠溶液：称4.8g过碘酸钠NaIO下标始4下标终溶于38mL蒸储水中,力口62mL正磷酸 浓 ,充分混合,置于棕色磨口瓶中,室温保存.11/1883.2.5碑试剂：称10g碑酸钠NaAsO下标始2下标终和7.1g无水硫酸钠溶于100mL蒸储水中,加0.3mL浓硫酸,置于带玻璃塞的瓶中,置4c保存.83.2.6硫代巴比妥酸试剂： 称1.2g硫代巴比妥酸和14.2g无水硫酸钠参加200mL蒸储水中,在煮沸的水浴中加热溶解,每周新配.83.2.7酸化丁醇试剂：于100mL正丁醇中力入5mL浓盐酸,置棕色带玻璃塞的瓶中,室温保存.83.3神经氨酸酶活性测定83.3

19、.1病毒用生理盐水做系列倍比稀释1：21：32分装小试管,每管0.1mL.标准病毒和未知病毒的神经氨酸酶应在同一试验中测定.83.3.2每管补充参加0.1mL生理盐水,再参加0.1mL用pH5.9PBS配制的胎球蛋白底物,对照管用盐水代替病毒,充分混合后置37c水浴作用18h.83.3.3从水浴中取出试管在室温冷却,每管参加0.1mL的过碘酸盐试剂,充分混合,室温静置20min时间要准.83.3.4每管参加1mL碑试剂,由于碘的释放出现棕色,摇动试管待棕色消失.83.3.5每管参加2.5mL硫代巴比妥试剂,并充分混合该试剂需在煮沸溶解后参加,用棉塞将管口堵紧.83.3.6马上将试管置于煮沸的水

20、浴中,煮沸12/18出现,即为神经氨酸酶活性的表现,颜色越深酶活性越高.83.3.7将试管置冰水中冷却后去掉棉塞,参加4mL丁醇试剂,换上干净橡皮塞,用手剧烈摇动试管,提取颜色使其转到有机物丁醇相.83.3.8以1500r/min离心510min使丁醇层清亮透明,小心地吸出上层的丁醇,放入干净的试管中待检.83.3.9将上述受检样品由高稀释度到低稀释度依次倾入透光池中,其中第一个透光池参加无病毒的对照管液,将分光光度计波长调至549nm将对照管调至零,然后依次读取每个稀释度样品的光密度.83.3.10酶单位的计算：酶活性测定时光密度为0.450.85的病毒稀释度作为一个酶单位.83.4神经氨酸

21、酶抑制试验83.4.1按上述方法测定酶活性,选用1个酶单位的病毒稀释度即酶活性10min,可见红色测定时光密度为0.450.85的病毒稀释度,每管加入0.1mL.83.4.2受检血清做系列倍比稀释,每管病毒参加不同稀释度血清0.1mL,血清对照管是以最低稀释度血清加生理盐水代替病毒,37c水浴作用1h.以同法做正常血清对照组.83.4.3每管参加pH5.9PBS配制的胎球蛋白0.1mL,充分摇匀,置37c水浴中孵育18ho83.4.4自水浴中取出试管,按B3.3.3.B3.3.7逐步参加前述13/18各种试剂.83.4.5测定光密度时应从低稀释度血清管至高稀释度血清管,检测方法同B3.3.9.

22、83.5神经氨酸酶抑制抗体滴度的计算法83.5.1根据抗血清和正常血清两组试验的实验结果,求得每组血清同一稀释度的光密度之商数,即为经血清作用后所余之酶活性的百分数.血清稀释度越高,残留的酶活性也越高,找出50%酶活性前后两个血清稀释度及其相应的酶活性百分数,按公式计算出血清神经氨酸酶抑制抗体滴度.83.5.2计算公式式中：A血清神经氨酸酶抑制抗体效价倒数；B下标始1下标终一一酶活性高于50%的血清稀释度倒数；B下标始2下标终一一酶活性低于50%的血清稀释度倒数；C下标始1下标终一一高于50%的酶活性的百分数；C下标始2下标终一一低于50%的酶活性的百分数；50常数.B3.5.3计算举例先计算

23、血清作用后的酶活性：然后将对数稀释度换算为几何稀释度：例如10上标始3上标终换算为1/1000,10上标始3.5上标终换算为1/3200.最后代入公式：此抗血清的神经氨酸酶抑制效价为1：1440.14/18附录C提示的附录流感快速诊断方法C1直接检查呼吸道脱落上皮细胞内抗原C1.1原理由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮细胞,因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原,通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断.检查方法可采用免疫荧光法,一般于34h内即可完成,而且可以直接定型.C1.2标本的收集和制片儿童标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物,成人标本最好采用鼻咽洗液.可将每份标本分为

24、两份,一份低温冻存备作病毒别离,一份用pH7.2磷酸缓冲液PBS,将粘液吹打散,1500r/min离心15min去除上清,细胞沉淀用PBS洗12次,末次离心后弃上清,参加适量pH7.2PBS使细胞重悬,滴加于带圈的玻璃片上,自然枯燥,冷丙酮固定10min.C1.3间接免疫荧光法C1.3.1用10%新鲜羊或牛血清封闭标本片,置湿盒中于37C30min.C1.3.2分别参加适当稀释度的抗甲型和乙型流感型特异性单克隆抗体,置湿盒中于37c放置1h.在PBS中洗两次,共10minc15/18C1.3.3加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物置37C1ho在PBS中洗三次,共10min,末次用蒸储水过一下.C

25、1.3.4于荧光显微镜下观察结果,观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性细胞即可判为阳性.C2标本经敏感细胞增殖1代后查抗原C2.1原理病人呼吸道标本经接种敏感细胞狗肾传代细胞MDCK!殖13d后,将细胞消化分散制成抗原片,再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内抗原.由于标本中的病毒在敏感细胞增殖后查抗原,能明显提升其诊断的敏感性,可在细胞病变出现以前查到抗原,可以直接定型,而且比常规鸡胚别离病毒法要快得多,一般2472h即可诊断.检查方法可采用间接免疫酶染法C2.5或间接免疫荧光法C2.4C2.2标本的收集及处理儿童标本可采用咽拭子,最好采用负压抽吸法；成人标本可采用咽漱液,最好采用鼻咽洗液.标本按附录A标准的附录中A2.3方法处理