PCR技术的基本原理

1、PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核甘酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链 DNA为模板，借助一小段双链 DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核甘酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核甘酸加到引物3 -OH末端，并以此为起始点，沿模板 5' 一昉向延伸，合成一条新的 DNA互补链。PCR目录PCR原理PCR反应体系与反应条件PCR步骤 PCR检测 PCR反应特点 PCR仪器聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分

2、子生物学技术，用 于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNA polymerase I )最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的 Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不 耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌 (Thermus aquaticus )分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于 80年代之后。PCR最初的原始

3、雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis 发展出的，Dr. Mullis当年服务于 PE公司，因 此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis并于1985年与Saiki等人正式表了第一 篇相关的论文。此后， PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研 究方法难望其项背。随后 PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物 学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了

4、 1993年诺贝尔化学奖。编辑本段PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在 DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分 子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成 为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入 DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了 PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用

5、有里程碑的意义，该酶可以耐受 90 C 以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核甘酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA的变性： 模板DNA经加热至93 C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 c左右，引物与模板 DNA单链的互补序

6、列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链：而且这种新链又可成为下次循环白模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。编辑本段PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10 X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100Pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至

7、100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）编辑本段PCR步骤标准的PCR过程分为三步：1 .DNA变性（90C-96C）:双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNA2 .退火（25C-65C）:系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。3 .延伸（70C-75C）:在Taq酶（在72c左右最佳的活性） 的作用下，以dNTP为原料， 从引物的5'端一3'端延伸，合成与模板互补的 DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶

8、活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成， 因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60 C-65 c间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。编辑本段PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（澳化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。 近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。编辑本段PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特

9、异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10- 12）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR

10、反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA扩增液和 水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在 24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳 分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。PCR的循环参数1、预变性（Initial denaturation ）.模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般 95 c加热3-5分钟。2、引物退火（Primer annealing ）退火温度一般需要凭实验（经

11、验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在 72 c进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95 C, 30秒足以使各种靶 DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72 c维持5-15分钟.使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。（四）PCR中的污染和假阳性PCR中污染主要来自1、样品间交叉污染；2、先前PCR产物遗留（carry-over ）编辑本段PCR仪器pcr仪器的发展pcr

12、温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自 perkin -elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和 自动化的方向发展。为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下（表22-5）;这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式 pcr,方便实用

13、。以上各种仪器一般都配有微电 脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温白温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。国内外生产的几种 dna扩增仪1109 型北京新技术所与军科院联合机械臂 变温水浴 电子调温40

14、 X0.5ml16400元/台90a/b 型中科院遗传所机械臂 变温水浴 电热14000元/台 ptc-51a/b 型 军事医学科学院 变温气流 电子调兼作套式30 X0.5ml12000元/台dna thermal cycler perkin -elmercetus（美） 变温铝块压缩机致冷48 X0.5mlus $ 20000.- thermocycler # 60 # 00 # 180b.braun biotech（德）变温水浴98 c四档电热，自来水冷却60X1.5ml100X1.5ml180X1.5mldm 30000.-automatic temperature cy-cler s

15、ingle block twin block ericomp inc.（美）变温铝块25100 c电热，自来水冷却29X1.5ml58X1.5mlus $4985.-us $7980.-grant autogengrant instrumant ltd（ 美）变温水浴099 c电热，自来水冷却或加冷循环器50X1.5mlor50X1.5mlus $250. -plusus $ 15.-forrack（x2）techne phc-1phc-2techne ltd.（英）变温铝块099 c三档电热500w水冷100w54 X0.5ml54 X0.5ml24X1.5ml£ 3383.-&#

16、163; 3997.-bioovenbiothrm corp（美）变温气流-150 C115v 11a200' s of 4 X96plateus $ 2990.-trio-thermo-block tb-1biomertra（德）半导体变温220v3X20 管分别控温dm12900.-micro cycler eeppendorf（美）变温铝块220v/100v3X29 管us $ 3500.-PCR常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性

17、，酶的质量及，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或澳乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因

18、。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR扩增的特

19、 异 性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或100ul ,应用 多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如20ul后， 再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现 假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与 模板的结合而降低 PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶 锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 P

20、CR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新 设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物

21、质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用 离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射， 以破坏存在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短， 但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。 其次是酶的质和量，往往一些来

22、源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 C变性，65 C左右退火与延伸）。 出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减 少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量， 减少循环次数。克隆PCR产物1）克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插

23、入片段：载体比需实验确定。1: 1 （插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比 1 :8或8: 1也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的 T4连接酶，插入片段共 10ul。室温保温1小时，或4 c过夜。在这2种温度下，缺T-凸出 端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温 1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率， 需4 c过夜。2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆

24、前做凝胶纯化。3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨茉失效，或污染上带有氨茉抗型的质粒，或产生氨茉抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。 用SOC稀释到1000ul 后，用100ul铺板。培养过夜，产生 1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA 的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA ,用1/10铺板，共用1 ng DNA 。转化率为

25、：1000 克隆 X10 （3 次方） ng / 铺板 1 ng DNA ug=10（6 次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10 （8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤 10 （8次方） cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801 , M1804 , M1794 ）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy 载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态

26、细胞 （10 （8次方）cfu/ug ）,按照指定的实验步骤，可得 100个菌落，其中60%应为白斑，如 产生20-40蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接有问题。4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4c过夜。B）插入片段带有污染，使3'-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量 的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T或pGEM-T Easy 载体3'-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化

27、的插入片段，因受 UV过度照射，时有发生。 UV 过度照射会产生喀咤二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热 DNA聚合酶的扩增产物末端无 A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核甘酸可在末端加 A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042 ）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10 X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各101

28、00Pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核甘酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp ,常用为20bp左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%

29、为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特 异条带。ATGC最好随机分布，避免 5个以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1lumol或10100Pmol ,以最低引物量产生所需

30、要的结果为好， 引物浓度偏 高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶， 另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒 状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris 。 HCL的缓冲液将其 PH调节到7.07.5 ,小量分装，-20

31、 C冰冻保 存。多次冻融会使 dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L ,尤其是注意 4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板（靶基因）核酸 模板核酸的量与Z化程度，是 PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病 原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫鼠酸月瓜或蛋白酶 K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各 种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为