2019年抗生素微生物检定法

1、uj iduj*5 5 匕0 p, c o m 好好学习天天向上德信诚培训网抗生素微生物检定法一、目的：阐述抗生素微生物的检定法。二、适用范围：适用于抗生素微生物检定法。三、责任者：品控部。四、正 文：1简述抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后 二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。抗生素管碟检定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在 一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径(面积)呈线性关系，通过比较标准品与供试品产 生

2、抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。抗生素效价以"单位(u)”或“微克(ug)”表示。2仪器与用具2.1 操作室 光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作问，一 部分为半无菌操作间。半无菌操作间，设有紫外线灯达到空气消毒。应装有空调设备，控制 室温在20-25 C o操作台可用稳固的水泥台，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准，保持水平。 室内注意抗生素的污染。2.2 双碟 为硬质玻璃或塑料培养平皿，内径约90mm高16-17mm碟底厚薄土§匀水平, 无气泡.碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加2-3ml,再滴加蓝墨水， 观察蓝色深汪是否一致.用

3、过的双碟经高压灭菌倒出培养基后 ，置玻璃仪器专用洗液或其他 清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150-160C干热灭菌2小时或高压121c蒸气灭菌30分钟, 备用。2.3 陶瓦盖 内径约为103mm外径108 mm平坦，吸水性强，应定期干燥、清洗。2.4 钢管 内径(6.0 ±0.1 ) mm高(10.0 ±0.1) mm 外径(8.0 ±0.1 )或(7.8 ±0.1 ) mm每套钢管重量差异不超过土 0.05g,内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。每次使 用后应置1: 1000新洁尔灭溶液内，浸泡2小时以上，进行灭菌后再行洗涤，先用水洗涤，更多免费资

4、料下载请进： http:好好学习社区uj iduj*5 5 匕0 p, c o m好好学习天天向上德信诚培训网淋干，再用蒸储水冲洗3超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条擦内外壁， 用水冲洗, 次后，置带盖的溶器内，在150-160 C干热灭菌2小时备用2.5 钢管放置器置于半无菌操作间内，有6孔和4孔两种，钢管下落时应垂直平稳、位置正确，双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75叱醇棉擦试，并用乙醇棉炎焰烧小孔。置钢管的玻璃管定期干烤灭菌。2.6 恒温培养箱 隔水式为宜，35-37 C及24-26 C,隔板上可备有带孔的玻璃板并垫 平。2.7 灭菌刻度吸管吸取菌液及培养基用。试

5、验用后应立即置5%5炭酸或者0.2%新洁 尔灭溶液中消毒后再按玻璃容器常规洗涤。吸口处塞入脱棉（应松动，透气） ，置适宜容器 中，120 c以上干热灭菌2小时或121c蒸气灭菌30分钟，烘干备用。2.8 玻璃容器包括滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶等，按“玻璃器皿检定规程” 进行标定，要符合一等品规定，每次应用前用清洁液浸泡，水冲洗、蒸储水冲洗3次，淋干。好好学习社区更多免费资料下载请进：http:uj iduj*5 5 匕0 p, c o m好好学习天天向上德信诚培训网2.9 称量瓶 具塞，重量在10 g以下。用毕先用水冲洗、淋干，置清洁液浸泡 2小时以上，水先、蒸储水冲洗 3次，置洁净的大

6、平皿中，在120c干热3小时，待冷至70-60 C时，取出置于干燥器中备用。2.10 毛细滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。应用前清洁液浸泡、水冲洗、蒸储水冲洗3次，置适宜容器中，在120c干燥3小时备用。2.11 天平 分析天平，感量0.1mg。2.12 抑菌圈直径（面积）测量仪。2.12.1 可用CHEffi抑菌圈面积测量仪及适当的测试仪。 仪器必须按抑菌圈测量仪检验 规程检验，符合规定者方能应用2.12.2 游标卡尺 精度0.05 mm,长度125 mm2.13 超净工作台用于菌种的接各或传代。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。3试液3.1 灭菌缓冲液 制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后

7、的缓冲液应澄明，分装于玻 璃容器内，经121c蒸气灭菌30分钟备用。3.1.1 磷酸盐缓冲液（PH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g,加水使成1000ml, 滤过。3.1.2 磷酸盐缓冲液（PH7.0）取磷酸氢二钾 9.39g与磷酸二氢钾 3.5g,加水使成1000ml,滤过。3.1.3 磷酸盐缓冲液（PH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水使成 1000ml,滤过。3.1.4 磷酸盐缓冲液（PH0.5）取磷酸氢二钾35g,加氢氧化钾液（10mol/L） 2ml,加 水使成1000ml,滤过。4 培养基培养基中原料的质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果的精确度影响较大，

8、因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培 养基后，置115C, 20分钟溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整 PH值，分装灭菌 备用。好好学习社区更多免费资料下载请进：uj iduj*5 5 匕0 p, c o m 好好学习天天向上德信诚培训网根据中国兽药典2005年版，抗生素微生物检定法中选用不同处方的培养基。目前市场已有干燥培养基商品生产、供应。临用时按照使用说明书进行配制，但注意培养基的PH应符合规定，否则必须校正后，灭菌备用。5试验用菌种检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种。5.1 菌种的复苏与保存在无菌室

9、或超净工作台内进行。5.1.1 菌种的复苏 把冻干菌种管、灭菌1 ml毛细滴管、双碟、银子、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。 将冻干菌种管外壁用磺酒擦洗消毒、 稍干，用75叱醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端，使骤冷而炸裂。 取灭菌银子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取 1支灭 菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随 即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒 液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35-37 C培养2

10、2-24小时。 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典 型菌落后，转种植代即可应用。如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。5.1.2 菌种的接种与保存 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用，标签一注明菌名用接种日期。自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒种，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火

11、焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞， 将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随 即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面 1支，照上述操作打开棉塞，将接种环但入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻 贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管用棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒 在火焰上烧灼灭菌。更多免费资料下载请进： 好好学习社区uj iduj*5 5 匕0 p, c o m 好好学习天天向上德信诚培训网 将已接种毕的细菌管置35-37 C培养22

12、-24小时，霉菌管一般置24-25 C霉菌培养箱内培养7日。取出后放入冰箱保存，一般 1-3个月转种一次。5.2 菌悬液的制备5.2.1 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis CMCC(B)63501 )悬液取枯草芽杆菌工作用 菌种营养琼脂斜面培养物加灭菌水 1-2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛 有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在 35-37 C培养7日。取菌苔少许涂片，革兰 氏染色镜检，应有芽抱85%Z上，用灭菌水10ml将芽抱洗下，制成芽抱悬液，合并至灭菌大 试管内，在70-75 C水浴内加热30分钟将菌体杀死，待冷后放冰箱贮藏为浓菌液。日常用菌悬液取

13、上述浓菌液，用灭菌水1: 3稀释至灭菌试管中，冰箱保存备用。5.2.2 短小芽抱杆菌Bacillus pumilus aureus CMCC(B)26003悬液取短小芽抱杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽抱悬液。5.2.3 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003 悬液取金黄色葡萄球 菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜上，在35-37 C 培养20-22小时，临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。此液在冰箱保存，可使用日。5.2.4 藤黄微球菌Micrococcus luteus CMCC(B)2800

14、1 悬液取藤黄微球菌工作菌种的 营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基田将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培 养瓶中，将菌液布满培养基表面，将培养瓶反放于培养箱中26-27 C培养24小时后，取出用 吸管吸取培养基R 5ml,至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大管中备用。该菌液在 冰箱中保存，可使用1-2月。5.2.5 大肠杆菌Escherichia coli CMCC(B)441033悬液取大肠杆菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌悬液制备方法进行，此菌液只供当天使用。试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，保持菌种的新鲜，对易变的菌株如藤黄 微球菌等在制备菌液前进

15、行单菌落的分离，选择典型菌落以保持悬液中菌群的一致性，所得 抑菌圈边缘清晰、整齐。6操作方法6.1 称量6.1.1 称量前，将标准品从冰箱取出，使与室温平衡；供试品应放于干燥器内至少30分钟方可称取。6.1.2 称量供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1-2小时更换天平内干燥剂。 更多免费资料下载请进：好好学习社区uj iduj*5 5 匕0 p, c o m好好学习天天向上德信诚培训网6.1.3 标准品与供试品的称量最好一次取样称取，不得将已取出的标准品或供试品倒 回听容器内，标准品称量不可少于 20mg取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好, 以免吸水。称样量的计算

16、:W=VCP式中 W 为需称取标准品或供试品的重量（mg；V为溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量C为标准品或供试品的浓度（单位 n/ml或©/ml）；P为标准品的纯度或供试品的估计效价（单位mg或©/mg）6.2 稀释稀释操作应遵照容量分析的操作规程。6.2.1 从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。6.2.2 标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。举例：取浓溶液1000仙/ml。第一步：取 5ml （1000仙 /ml） 一 50ml 量瓶中一 100u/ml。第

17、二步：取 5ml （100仙 /ml） 一 50ml 量瓶中一 10u/ml （H）。取 5ml （100仙 /ml） 一 100 ml 量瓶中一 5u/ml （L）6.2.3 每次吸取溶液用密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。6.2.4 稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，以免因PH或浓度不同影响测定结果。6.2.5 稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下， 再准确补加至刻度。6.2.6 （2.2）法，标准品与供试品高、低溶液浓度之比为 2: 1或4: 1。（3.3）法, 标准

18、品与供试品高、中、低溶液浓度之比为 1: 0.8。但所选用的浓度必须在剂量反应直线范 围内。6.3 双碾的制备在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的污染，培养基应在水浴 中或微波炉中融化，避免直火加热。好好学习社区更多免费资料下载请进：uj iduj*5 5 匕0 p, c o m 好好学习天天向上德信诚培训网6.3.1 底层用灭菌大口吸管（20ml）或其它灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注 入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放于35-37 C培养箱中保温，使易于摊布菌层。6.3.2 菌层取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量（2.2）法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18-22mm

19、 （3.3 ）法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌直径在15-18mm,用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48-50 C,芽抱可至60 C）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口 10ml吸管或其它分装器，吸取菌层培养基 5ml,使 均匀摊布在底层培养基上，置水平台上，用陶瓦圆盖覆盖，放置20-30分钟，待凝固，备用。6.3.3 放置钢管用钢管放置器，将干热灭菌的银子或适宜方法将钢管装于玻璃管中, 放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上，托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高度基本一致。钢管放妥后，应使双碟静置5-10分钟，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再

20、开始滴加抗生素溶液。6.4 滴加抗生素溶液6.4.1 每批供试品取4-10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2-3次。6.4.2 滴加标准品与供试品溶液，因实验设计方法不同而异。（2.2）法，在双碟的4个钢管中分别成对角滴加标准品（S）及供试品（T）高（H）、低（L）两种浓度的溶液。（3.3）法的 6个钢管中间隔3个钢管分别滴加标准品及供试品高、中（刈、低3种浓度溶液，并使相同 浓度成对角。滴加溶液的顺序：（2.2）法SHTHSLTL;（3.3）法SHTHSMhTMHSLTL。 滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。6.4

21、.3 每份滴加的溶液为1单位，但双碟数每次不超过5个，如1份溶液滴加双碟数 目多，可分次滴加。每种溶液各用 1支毛细滴管。6.4.4 滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过 3个, 避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入培养箱中间位置，35-37 C或30-32 C 培养至所需时间。6.5 抑菌圈测量6.5.1 将培养妥的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入盛有1: 1000新洁尔灭溶液或其它消毒液内，换以玻璃盖，按样品号排妥；测量抑菌圈前应检查抑菌是否圆整，如有破圈 或圈不圆整应将该碟弃之，切忌主观挑选抑菌圈及双碟，使结果造成偏倚。6.5.2 测量换菌圈可用抑

22、菌圈自动测量分析系统，也可用游标卡尺；使用游标卡尺测更多免费资料下载请进：好好学习社区uj iduj*5 5 匕0 p, c o m好好学习天天向上德信诚培训网量时，眼睛视线应与读数刻度垂直，用游标卡尺的尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量7 记录与计算7.1 试验记录应包括抗生素的品种、剂型、标示量、生产厂、批号、检验目的、检验 依据、检验日期、温度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人，抑菌圈测量结 果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录清。当用测量 仪测量面积或直径时，电脑测试、计算、统计分析的打印纸贴附于上。7.2 计算7.2.1 剂量法计算公式T

23、2+T1-S2-S1P=log-1x I X 100%T2+S2-T1-S1式中P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）；&为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；S为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；I为高、低剂量之比的对数值，2: 1时，1=0.301 。4: 1时，1=0.602举例乳糖酸红霉素效价测定结果计算（见表 1）。估计效价（Ar） =6.03u/mg剂距（I） =0.30115532+12528-15491-12472P=log-1义 0.

24、301 X100%=101.12%15491+15532-12472-12528效价（Pr） =PX Ar=603 u/mg x 101.12%=609.75 u/mg好好学习社区更多免费资料下载请进：uj iduj*5 5 匕0 p, c o m好好学习天天向上德信诚培训网表1抑菌圈面积结果SHSLTHTL115711276158112682148111991523117331523130214971263415181214153312265157312371543126861546121915801224714951260152612408153012371548126391605125615931293101649127216081320154911247215532125288结果判断8.1 可靠性测验 该法的设计是根据量反应平行线原理，在实验所用的剂量范围内， 对数剂量和反应呈直线关系，供试品和标准品的直线应平行。当用卡尺测量后的结果，将参 数输入电脑，有专用(2.2)法和(3.3)法的软件程序进行统计学处理。用测量仪测量抑菌圈时， 测量与统计学处理一次完成，统计学分析按药典生物检定统计规定进行 F的显著性测验。(2.2) 此法要求直线回归、剂问P< 0.01 ,偏离平行P>0