慢性哮喘小鼠EGFR的表达及地塞米松对其的影响

1、慢性哮喘小鼠EGFR的表达及地塞米松对其的影响【关键词】 哮喘Expression of epidermal growth factor receptor and its ligands in chronic asthma mice and the influence of dexamethasone【Abstract】 AIM: To investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) system on the asthmatic airway remodeling.METHODS: The chronic a

2、sthma mice model was established by ovalbumin (OVA) immunization. Mice were injected intraperitoneally with dexamethasone of 2 mg/kg 1 h before the sensitization and sacrificed by cervical dislocation 24 h after the last challenge. Conventional pathological slides were also observed to study the pul

3、monary inflammation and the thickness of airway wall and airway smooth muscles. The concentration of TGF in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was detected by ELISA. RTPCR was conducted to detect the mRNA expression of EGFR in the lungs. Pulmonary EGFR protein was observed by immunohistochemical st

4、aining and Western blot analysis. RESULTS: In chronic asthma mice, inflammatory cell infiltration around bronchi and vessels could been seen on slides. The airway wall and the airway smooth muscles thickened and TGF in BALF increased. The expression of EGFR mRNA and protein in the lungs increased (P

5、<0.01). Dexamethasone injection before sensitization decreased TGF in BALF and the expression of phosphoEGF receptor protein in the lung alleviated the pulmonary inflammation and inhibited the thickening of airway wall and airway smooth muscle (P<0.01). CONCLUSION: Airway remodeling oc

6、curs in the chronic mice asthma model. Early dexamethasone injection can inhibit the expression and activation of EGFR system, decrease the TGF concentration in BALF and prevent the airway remodeling.【Keywords】 asthma; airway remodeling; receptor, epidermal growth factor; transforming growth factor

7、alpha; dexamethasone【摘要】 目的： 探讨表皮生长因子受体（EGFR）在慢性哮喘气道重建中的作用. 方法： 建立小鼠慢性哮喘模型，致敏前1 h气道内滴入地塞米松2 mg/kg，最后一次激发24 h后处死动物，常规病理切片观察小鼠肺内炎症情况、气管壁厚度及气道平滑肌厚度，ELISA法测定肺泡灌洗液中TGF的浓度，RTPCR观察小鼠肺部EGFR mRNA的表达，免疫组化及Western Blot观察EGFR蛋白的表达. 结果： 慢性哮喘组小鼠气道支气管及血管周围大量炎症细胞聚集、气管壁及气道平滑肌增厚、肺泡灌洗液中TGF浓度增高，肺组织EGFR mRNA及EGFR蛋白的表达增高

8、(P<0.01). 哮喘小鼠致敏前使用地塞米松可减轻气道炎症，减少气管壁及气道平滑肌的增厚，肺泡灌洗液中TGF浓度、肺组织磷酸化EGFR蛋白的表达较慢性哮喘组均有所下降(P<0.01). 结论： 慢性哮喘小鼠出现气道重建，早期使用地塞米松可以预防气道重建，降低BALF中TGF的浓度、抑制肺组织EGFR的表达和活化.【关键词】 哮喘；气道重建；受体，表皮生长因子；转化生长因子；地塞米松0引言气道重建是哮喘的特征性病理改变，成为顽固性哮喘的病理基础，直接影响治疗效果，是目前哮喘研究的热点问题之一. 我们建立了小鼠慢性哮喘模型，观察了慢性哮喘小鼠气道重建情况、表皮生长因子

9、受体（epidermal gronth factor receptor, EGFR）和其配体表达的变化及地塞米松对其的影响，旨在探究EGFR系统在慢性哮喘气道重建中的作用.1材料和方法11材料6周龄雌性BALB/C小鼠40只，体质量2025 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；UV1000紫外分光光度计（英国Cambridge公司）；DYA型电泳仪（上海生化所申华生化技术开发公司）；PCR扩增仪（GeneAmpPCRsystem 9600 PERKIN ELIMER）； FLUORSTM Multimager多功能图像分析仪（BioRAD）；Leica Q500 MC图像分析系统（德国）

10、；卵白蛋白干粉（Grade）（美国Sigma公司）；氢氧化铝（上海生物制品有限公司）；地塞米松磷酸钠注射液（天津市氨基酸公司人民制药厂）；小鼠TGF ELISA试剂盒（上海生物晶美公司）；Trizol（Gibcol BRL公司）；One Step RNA PCR Kit （TaKaRa公司）；EGFR mAb（Cell Signaling Technology）；磷酸化EGFR mAb（Cell Signaling Technology）.12方法121动物模型及分组健康BALB/C小鼠40只，随机等分为4组，每组10只，A组为正常对照组，B组为慢性哮喘组，C组为地塞米松处理组，D组为生理盐水

11、处理组. 置于相对清洁恒温环境. 予以标准饲料，自由取水. 参照文献1制备动物模型，将OVA 20 g加2.6 mg氢氧化铝溶于pH为7.4的PBS 0.2 mL中，于第0, 7, 14日给B组、C组、D组小鼠腹腔注射，A组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS；于第2029, 47, 61, 7375日鼻腔内滴入OVA抗原液50 L（含OVA 100 g），A组小鼠鼻腔内滴入PBS 50 L；C组小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射地塞米松0.2 mL（50 g），D组小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射PBS 0.2 mL. 小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛为阳性反应. 最后一次激发24 h后颈

12、椎脱臼处死动物.122BALF中TGF的检测按照ELISA检测试剂盒操作流程检测各组小鼠BALF中TGF含量.123肺组织EGFR mRNA的测定根据One Step RNA PCR Kit试剂盒说明书，用半定量RTPCR法测定各组小鼠肺组织EGFR mRNA. EGFR引物序列(扩增片段长499 bp)： 上游引物5AGAAGATGGCATCCGCAAGT3；下游引物5ATTGGG TGTCCCGAAGAGTT3. GAPDH引物序列(扩增片段长306 bp)： 上游引物5 cctgcatccactggtgctgc3；下游引物5 CTTGACAAAGTTGTCATTGA3.124Wester

13、n blot印迹测定测定肺组织EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白表达.125肺组织病理变化处死动物后，取肺组织置于60 g/L固定24 h，常规制备病理切片，HE染色后观察肺组织病理变化. 结果为细胞核呈蓝黑色，胞质呈淡红色. 参照文献2关于气道各层的定义，采用德国Leica Q500 MC图像分析系统，测定不含软骨的完整气管横断面，分别以WAt/ Pbm， WAi/ Pbm， WAm/ Pbm表示气管总管壁厚度、内壁厚度及气道平滑肌厚度.12.6小鼠肺组织EGFR免疫组织化学染色采用LSAB法. 处死小鼠后，取每只小鼠肺门支气管组织行免疫组织化学染色，随机计数50个支气管平滑肌细胞（每组共计数

14、500个），结果判定：-为无棕色颗粒沉淀或棕色颗粒少量、稀疏；为细胞膜区域出现淡黄色颗粒沉淀；为细胞膜区域出现黄色颗粒沉淀；为细胞膜区域出现棕色颗粒沉淀.统计学处理： 计量资料以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件，表1资料组间比较采用Kruskal Wallis检验，组间比较采用方差分析，免疫组化结果排成列联表，进行2检验.2结果21慢性哮喘小鼠肺组织病理变化及地塞米松的干预哮喘小鼠可见上皮细胞破坏,支气管、血管周围大量炎细胞浸润，以嗜酸粒细胞、淋巴细胞为主，地塞米松处理组炎症减轻，生理盐水处理组无变化. 图像分析显示，哮喘组小鼠气道壁、内壁、气道平滑肌层均增厚；地塞米松处理组

15、小鼠气道壁总厚度、内壁、气道平滑肌层厚度明显薄于慢性哮喘组小鼠（P<0.01,表1）,与正常对照组相比，差别无统计学意义；生理盐水处理组与慢性哮喘组相比，差别无统计学意义.表1各组小鼠气道形态学参数比较 (略)22慢性哮喘小鼠肺组织EGFR mRNA, EGFR蛋白、磷酸化EGFR蛋白的表达及地塞米松对其的影响慢性哮喘小鼠肺组织EGFR mRNA, EGFR蛋白、磷酸化EGFR蛋白的表达量较正常对照组明显增加（P<0.01）；地塞米松处理组小鼠肺组织EGFR mRNA, EGFR蛋白表达与慢性哮喘组比较差别无统计学意义；地塞米松处理组小鼠肺组织磷酸化EGFR蛋白的表

16、达较慢性哮喘组下降（P<0.01，图1，2，表2）.表2各组小鼠肺组织EGFR mRNA相对量比较(略)2.3各组小鼠肺组织免疫组化正常对照组小鼠气道黏膜上皮细胞、气道平滑肌细胞及血管平滑肌细胞可见较弱的磷酸化EGFR表达. 慢性哮喘组磷酸化EGFR阳性细胞数明显增加，主要表达于气道黏膜上皮细胞、气道平滑肌细胞及血管平滑肌细胞. 地塞米松处理组阳性表达的细胞数明显低于慢性哮喘组（P<0.01,表3）.表3各组小鼠磷酸化EGFR免疫组化结果（略）24慢性哮喘小鼠BALF中TGF含量变化及地塞米松的干预慢性哮喘小鼠BALF中TGF含量（0.764±0.065）

17、 ng/L明显高于正常对照组（0.259±0.032） ng/L （P<0.01）. 地塞米松处理组小鼠BALF中TGF含量（0.282±0.024） ng/L明显低于慢性哮喘组（P<0.01），而与正常对照组差别无统计学意义.3讨论支气管哮喘是全球范围内严重威胁公众健康的慢性疾病. 通过大量病理学的研究证明，慢性气道炎症和气道重建是哮喘的两个主要病理学特征3 ，其中气道重建倍受学者关注. 气道重建包括支气管上皮脱落、杯状细胞肥大、基底膜增厚及黏膜下组织和平滑肌增生、肥大，与临床症状、肺功能、气道高反应性密切相关4,因此研究哮喘气道重建及其防治措

18、施具有重要意义.气道重建的发生机制尚未完全明确，许多研究5均表明炎症细胞、炎症因子及可溶性生长因子等在其中发挥重要作用，但引起气道重建的各种细胞因子、炎症介质、生长因子以及信号的传递通路尚未完全明确，在进一步的研究过程中. 表皮生长因子（epidermal growht factor, EGF）和EGFR在气道重建和修复中也起重要作用6. EGFR是第一个被发现并克隆的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK），是细胞生长、分化和存活的重要调节因子. 近年来对EGFR的研究取得了一些重要进展，其所介导的信号传导效应具有多向性，包括增殖、迁移、细胞分化和内环境的

19、稳定等，并与细胞的再生和恶性肿瘤的发生、发展密切相关. EGFR包括膜外区、跨膜区、膜内区3个部分. 当配体与受体的胞外区结合后，受体胞内部分的酪氨酸残基磷酸化，形成酪氨酸底物结合位点，使EGFR激活，再通过识别一系列底物酶将外界信号传导至细胞内，介导DNA合成及细胞增殖效应7-10.我们通过对小鼠哮喘模型各组的研究，证实了卵蛋白的长期吸入可诱发气道重建，包括气管壁和气道平滑肌层的增厚，肺组织EGFR mRNA, EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白及气道平滑肌磷酸化EGFR表达增强，BALF中EGFR配体TGF浓度增高. 因此推测与细胞分化、增殖密切相关的EGFR系统可能与气道重建有一定关系.

20、哮喘时气道分泌炎症介质、细胞因子、生长因子及慢性炎症导致气道损伤，引起EGFR系统活化，参与气道修复，而过多的修复引起气道壁和气道平滑肌层增厚. 此外，本研究还发现，激发前使用地塞米松可以有效地预防气道重建. 糖皮质激素是目前首选的控制气道炎症及防止气道重建的药物. 许多研究表明应用皮质激素可有效地改善肺功能和气道阻塞. 但是，目前对皮质激素在气道重建中的作用机制了解较少. 研究发现地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙可抑制体外培养的气道平滑肌细胞增殖，地塞米松还可抑制凝血酶，胎牛血清，EGF, bFGF对气道平滑肌的促有丝分裂11-14. 本研究发现地塞米松对肺组织EGFR mRNA, EGF

21、R蛋白表达无影响，但可降低BALF中TGF浓度，减少肺组织及气道平滑肌磷酸化EGFR蛋白表达. 推测地塞米松预防气道重建可能存在的机制： 通过抑制炎症反应，有效地预防气道重建. 通过抑制炎症介质、细胞因子及生长因子（如TGF）的分泌，抑制EGFR系统活化，预防气道重建.【参考文献】1 Henderson WR, Tang LO, Chu SJ, et al. A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model J. Am J Respir Crit Care Med, 2002,165(1

22、):108-116.2 James AL, Hogg JC, Dunn LA, et al. The use of the internal perimeter to compare airway size and to calculate smooth muscle shortening J. Am Rev Respir Dis, 1988,138:136-139.3 Fahy JV, Corry DB, Boushey HA. Airway inflammation and remodeling in asthmaJ. Curr Opin Pulm Med, 2000,6(1):15-20

23、.4 Davies DE, Wicks J, Powell RM, et al. Airway remodeling in asthma: New insights J. J Allergy Clin Immunol, 2003,111(2):215-225.5 Hamid Q. Airway remodeling in asthmaJ. J Allergy Clin Immunol, 2003,111(6):1420-1421.6 Davies DE, Polosa R, Puddicombe SM, et al. The epidermal growth factor receptor a

24、nd its ligand family: Their potential role in repair and remodelling in asthma J. Allergy, 1999,54:771-783.7Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, et al. The ErbB signaling network:receptor heterodimerization in development and cancer J. EMBO J, 2000,19(13):3159-3167.8 Lu Z, Jiang G, BlumeJensen P, et al. E

25、pidermal growth factorinduced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase J. Mol Cell Biol, 2001,21(12):4016-4031.9 Johannessen LE, Ringerike T, Molnes J, et al. Epidermal growth factor receptor efficiently activates mitogenactivated protein kinase in HeLa cells and Hep2 cells conditionally defective in clathrindependent endocytosis J. Exp Cell Res, 2000,260(1):136-145.10 Denning M