用聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备载多西他赛纳米颗粒的实用制备过程

1、用聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备载多西他赛纳米颗粒的实用制备过程背景：用生物可降解和生物相容性聚合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备纳米粒 是药物传递系统中研究最深入的共聚物。该研究的目标是充分探究PLG倬内米粒药物传递系统在商业剂型中的发展。我们的目的是比较纳米粒制造过程中不同的 制备参数的影响。方法：载多塔赛西PLGAS米粒通过单一乳液技术和溶剂蒸发来进行比较。纳米 粒用各种技术进行探究，包括扫描电子显微镜对其表面形态，动态光散射对其尺 寸和zeta电位，X-射线光电子能谱对其表面化学和高效液相色谱对药物体外释 放动力学的研究。为了得到更小的纳米粒，采用0.2%聚乙烯醇，0.03%D-a-生育酚聚

2、乙二醇1000琥珀酸钠（TPG$, 2%白洛沙姆188, 130瓦功率超声五分钟， 磁力搅拌蒸发，和每分钟8000转的离心条件。为了提高纳米粒的封装效率，不 同的条件效率也不同，即，2-5分钟的超声时间，70-120瓦功率，和5-25mg的 载药量。结果：选¥ 130瓦功率下超声5分钟，10mg载药量。在这种条件下，纳米粒达 到90%勺封装效率。药代动力学显示，包含泊洛沙姆 188, TPG峨者聚乙烯醇的 纳米粒在28天释放量分比为20.83%, 40.07%,和51.5%。TPG前泊洛沙姆比聚 乙烯醇的释放动力学要小。据预测，根据X-射线光电子能谱发现有药物残留在表面。结论：我们的

3、研究显示表面活性剂的选择对控制多西他赛的释放非常重要。关键词：多西他赛、纳米粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、不同的剂型、超声、封 装效率简介多西他赛是紫杉醇家族中的一个抗癌剂。 紫杉醇类似物多西他赛通过从欧洲 紫衫中提取的10-脱乙酰基果浆赤霉素III半合成得到的。多西他赛联合其他化 疗药物在治疗乳腺癌、胰腺癌、胃癌和膀胱通路上皮癌方面显示很高的治疗效果。 多西他赛水溶性低，临床上唯一使用的剂型是 40mg/mL包含聚山梨酯80的高浓 度溶液。这种赋形剂与一些过敏反应和其与普通聚氯乙烯经脉给药组不相容。为了消除聚山梨酯80为基础的赋形剂和提高药物溶解性，已经提出替代剂型，包 括脂质体和环糊精。纳米

4、粒的聚合物基体必须符合多重要求， 如生物相容性和生物可降解性，机 械强度，易于加工。大家熟知的控释的生物可降解性材料是聚乳酸-羟基乙酸共 聚物（PLGA。许多出版物已经介绍了用 PLGAeJ备纳米颗粒和配方变量的研究， 包括PLGA勺分子量，冻干剂，表面活性剂。因此，我们研究了用 PLGA!过溶剂 蒸发方法制备多西他赛来持续注射的配方。乳液的形成是制备纳米粒最重要的一步，因为乳滴的大小与最终纳米粒的大 小直接相关。这种乳液是通过含有多西他赛的有机相和包含表面表面活性剂或稳 定剂的水相混合制备的，可以用外部能量将其分散成小液滴，通过有机溶剂的蒸 发，纳米小液滴可以生成纳米颗粒。在该研究中，我们专

5、注于用 PLGAH备多西他赛纳米颗粒的细节。为了获得 更小的颗粒和更窄的粒径分布，我们根据乳化和蒸发条件改变了一些重要的参 数。首要目的是确定以PLGAH备多西他赛纳米颗粒的最佳制备条件。 材料和方法材料：有游离竣基的 PLGA50: 50 ResomerRG502H）是从 Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany威得的。多西他赛是 SamyangGeneCorporation (Daejeon, Korea)赠送的。聚乙烯醇是从 Sigma-Aldrich (Steinheim, Switzerland) 购买 的，87-89%的水解，分子量为1460

6、00-186000。泊洛沙姆188从 BASF (Ludwigshafen,Germany)购得。D-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸钠(TPGS和蔗糖从SigmaAldrich购得。所有其它化学试剂是分析级或试剂级商品，使用时无需进一步纯 化。纳米颗粒制备：包含多西他赛的纳米颗粒是用单一乳化技术和溶剂蒸发的方法制备的。简要地说，多西他赛溶解于2m氯甲烷中，再向该溶液中加入100mgPLGA 油相在冰浴条件下用探头超声波破碎仪 100瓦(VCX130 Sonic and Mateerials , Newtown CT)乳化2分钟。得到的油性溶液在冰浴条件下超声10分钟，进一步乳化成40mL含有

7、0.2%聚乙烯醇的水性溶液。，乳化后，水包油型乳液磁力搅拌8 小时，以蒸发掉有机溶剂。得到的纳米颗粒以8000转每分钟分离心20分钟分离。 最后，纳米颗粒用蒸储水洗涤除去残留的表面活性剂然后在蔗糖存在条件下冻 干。我们对流体粒子大小和药物封装效率百分比的各种处理参数进行了研究。处理参数包括水相中表面活性剂浓度和类型，初始载药量，超声时间和功率。除另外说明，所有实验是在其他变量不变的条件下仅改变一个变量条件下进行的。多西他赛评价：包含多西他赛的冻干纳米颗粒称重后溶解于二氯甲烷中。涡流15分钟后，二氯甲烷在氮气条件下挥发。产率、载药量、封装效率按如下方法 计算：产率(%=颗粒重量/含聚合物的药物重

8、量x 100载药量(% =颗粒中药物重量/颗粒重量X 100封装效率(0% =颗粒中药物重量/给药重量x 100颗粒大小，zeta电位和表面力测量：纳米颗粒的大小的分析用动态光散射分析仪(ELS-8000, Otasuka Electaxel , Tokyo, Japan)进行分析。含有多西他赛 的纳米颗粒加入到样品分散单元并进行超声，以减弱颗粒间的相互作用。遮蔽围维持在2%-50%用仪器测量样品30次可得到平均粒径。为了测量纳米颗粒的zeta 电位，制备含有多西他赛的水性稀释悬浮液并超声一分钟。根据表面活性剂的浓度，检查含多西他赛的纳米颗粒的表面力( Sigma 703D, Attensio

9、n/Biolin Scientific, Espoo, Finland )。扫描电子显微镜：扫描电子显微镜用来验证颗粒形状和大小的均匀性。冻干纳米颗粒洒落在双层碳带上。与铝和混合物在真空下包衣45秒，并用FE-SEIM(JEOLJSM7500,Thermo Scientific )在5千瓦条件下进行形态学检查。红外光谱和X-射线光电子能谱：含多西他赛纳米颗粒表面结构特征用傅里叶变 换红外光谱(FTIR, Nicolet 380, Thermo Scientific )在其固态条件下测定。 纳米颗粒样品在红外光谱的扫描围是400-4000cm-1.包含多西他赛的纳米颗粒的表面化学用X-射线光电子

10、能谱检查(Multilab 2000, Thermo Scientific ), 测得的光谱用80eV传递能量，结合能量围从0-1200eV。用制造商提供的软件进 行曲线拟合。载多西他赛的纳米颗粒体外释放曲线：对包含多西他赛的纳米颗粒的多西他赛 释放进行一式三份的研究，在室温下进行，用半透膜(molecular weight cut off 10,000 Da, MEMBRA-CEL, Chicago, IL )分离供体和受体介质。受体介质填充 100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液，以保证溶解度。相当于300八的大量纳米颗粒分散在供体介质中（5mD ,在定义好的时间点将1mL的样品从吸收介质

11、中撤回,并用等体积的新鲜介质替代。统计分析：学生的t检验作为对照组。P值小于0.05认为有统计学意义。结果与讨论载多西他赛的PLG&S米颗粒直径的影响因素：在制备的各步骤中，对影响载多 西他赛纳米颗粒的平均粒径的变量进行了研究。这些变量包括有机溶剂，聚乙烯 醇的浓度，TPGS和水相中白泊洛沙姆188,超声功率和时间，以及离心速度。 不同有机溶剂和表面活性剂的影响：乳液的形成是制备纳米颗粒最重要的一步， 因为乳滴的大小与最终的纳米颗粒的大小直接相关。这种乳液是用包含聚合物的 有机层和包含表面活性剂或稳定剂的水相混合制得，运用外部能量将其破碎为小液滴，这些纳米液滴在有机溶剂挥发后形成纳米颗

12、粒。首先，我们确定表面活性剂，即聚乙烯醇，TPGS或泊洛沙姆188在水相中 的最佳浓度。在标准条件下保持其他参数的恒定，改变表面活性剂浓度来确定浓 度对颗粒大小的影响。图1中，显示了水相中各表面活性剂的浓度下的纳米颗粒 大小和表面力。水相中表面活性剂浓度的变化为：聚乙烯醇0.1%-4%, TPGS0.015%-1%或者泊洛沙姆188 0.1%-4%;其它所有制备参数，包括超声时间和 药物浓度保持恒定。聚乙烯醇浓度的增加引起纳米颗粒大小的显著减少，减少量 为0.2%,这与表面力一致。这与低界面力一致，界面力减小从而颗粒大小也减 小。聚乙烯醇浓度增加0.2%颗粒大小也增加。其他研究者已经报道，增加

13、提高 聚乙烯醇浓度可以增加外部水相的粘度， 导致净剪应力的下降，颗粒大小也相应 增加。泊洛沙姆188浓度为4%寸颗粒大小为44.3 ± 0.7以由泊洛沙姆88浓度为2%寸颗粒大小为46.5 ± 1.2 pm.然而，当制备纳米颗粒时采用TPGS颗粒大小和表面力没有相关性。EZE) uo一 SU3scsJJn。 。 o 。 。 。 -a 。 8 7 6 5 4 3 2 Particle sizei23PVA concentration (%)T- Surface tensionTPGS concentration in water phase (%)B (UJS35 gwtEd

14、(ENE) IWmuyBUErns5 3 ikio 53 220 r00-5 0 5 0 55 4 4 3 3 2 *Partcle sizeSurface tension(Eu) Q-wEEd200 11111-0012345Poloxamer 188 concentration in water phase (%)图1含不同溶剂和表面活性剂的剂型的颗粒大小和表面力在前面的试验中，事先确定表面活性剂聚乙烯醇，TPGS和泊洛沙姆188的浓度分别为为2% 0.03%和0.2%。随后，使用三种有机溶剂，包括二氯甲烷， 氯仿和乙酸乙酯。用氯仿时，泊洛沙姆188, TPGSK聚乙烯醇制备的纳米颗粒的

15、大小分别为 290.2 nm 292.8 nm和 265.5 nm, zeta 电位分别为-19.27mV,-3.29 mV和-16.6 mV。用氯仿时，泊洛沙姆188, TPGS?聚乙烯醇制备的纳米颗粒的 大小分别为 340.5 nm 531.0 nm和 274.4 nm zeta 电位分别为 18.94 mV -20.39 mVf口-16.44 mV用乙酸乙酯时，泊洛沙姆188, TPGSffi聚乙烯醇制备的纳米颗 粒的大小分别为438.8 nm 1044.2 nm和393.6 nm, zeta电位分别为-20.75 mV -14.52 mV和-19.2 mV （图2）.根据以上结果，二氯

16、甲烷作为有机溶剂和0.2%聚乙烯醇作为水性溶剂时得到最小的颗粒大小。另据报道，表面活性剂的作用是 通过阻止凝聚而使乳化液滴稳定。为达到高效稳定的作用，表面活性剂分子必须 覆盖在有机溶剂和水相界面的所有液滴QPnkwafT hrTPGS PVA Pt>kinwr TPGS PVA Pnk宰heht TPGS PVAODO-10.00-15.00-20.00-2S.00(AE) -wBod 常zDCMChloroformEthyl acetate图2含不同溶剂和表面活性剂的剂型的颗粒大小和zeta电位超声功率和时间的影响：最小的纳米颗粒是在130瓦下超声5分钟得到的（表1）。因此，超声功率可

17、能会减小纳米颗粒的大小，可能是因为声纳能量可以通过乳化和减小平均颗粒粒径来增加能量的释放。表1超声功率和时间对纳米颗粒特征的影响wd ipgwqr (W)1Particle size,.ew加 ± $0 (nmZeta poWcmL EMH ± 40 (mV)Encapiulation efHcien 5 owa# ± 5D (%)X 70S M.S ± S3 J4H108S。3& ±3511 18412.Q±12J-937 ± 07457J5 土 5.67上 12加.&士 w-9.(J 1 IM7MI &#

18、177;125ITO4地&土制3TJ9 土 111k 3mi + »,«-I2.4S + Z377tAl ±167鼠l»IMS ±10.1-li.Oi IM弛心± 175io. ro7取 ± LA±«4BIC, IW-7.51 1 O,T»* 上帛 川ia. do峥*-7,Wti.2lM t 1 X蒸发方法和时间的影响：除去有机溶剂的方法对纳米颗粒的大小有非常重要的影响。我们用旋转蒸发仪和磁力搅拌得到了亚微纳米颗粒，但是在氮气和减压条件下不可能得到亚微大小的颗粒。表 2中显示氮气有最快的

19、有机溶剂的蒸发率，但是也会导致得到的颗粒比磁力搅拌下得到的颗粒大。 这表明，有机溶剂去除的 蒸发率影响颗粒大小。图3显示，在制备纳米颗粒的过程中，不同磁力搅拌时间 对去除有机溶剂的影响。在搅拌时间分别为2,4,6小时条件下，纳米颗粒成聚集 状态并呈球形。因此，我们总结，在磁力搅拌下，至少需要蒸发 8小时来去除有机溶剂图3不同磁力搅拌时间对去除有机溶剂的影响(A)2小时(B)4小时(C)6小时(D)8小时表2搅拌时间对纳米颗粒大小的影响Solvent evaporation methodParticle sizeMean ± SD (nm)Rotavapcr (I hour)77&am

20、p;9 ± 39.SStirring overnight (8 hours)563.6 ± 24.8Nitrogen (30 minutes)12843 ± I ISVReduced pressure (I hour)2S697 ± 909.7离心速度的影响：图4显示纳米颗粒在不同离心速度下的制备。在每分钟 8000和10000转离心速度下，纳米颗粒呈球形，而且不聚集，但是在每分钟13000和15000转离心速度下会发生聚集。每分钟 8000和10000转离心速度相比较，在每分钟10000转速度下大的纳米颗粒伴有小颗粒。图4不同转速下纳米颗粒大小的电子扫

21、描显微镜图片。(A)8000 (B)10000 (C)13000 (D)15000载多西他赛纳米颗粒封装效率的影响因素：在载多西他赛PLGA纳米颗粒制备过 程中，对影响封装效率的影响因素进行了研究。 这些因素包括按顺序混合的有机 相，药物用量，超声功率和时间，有机溶剂类型和水相中聚乙烯醇，TPGS或者泊洛沙姆188的浓度。有机相混合顺序的影响：为了优化载多西他赛PLGAI内米颗粒的用量，我们对制 备这些颗粒的不同试验条件进行了评价。我们将有机相的制备对颗粒的影响进行 了评价，对多西他赛封装效率的影响列于表 3中。纳米颗粒中，有机相按照 F4 方法制备，封装效率为78.78%,除此之外，初始载药

22、量的封装效率仅为3.64%-10.03%。因此，F4被选为有机相制备的方法。这可能是由于多西他赛和 聚合物都溶解时发生的不同相互作用，因此导致不同的封装效率。F4和其他制备方法也有不同聚合物浓度和混合方法，并且药物和聚合物之间也会发生相互作表3多西他赛和PLGA昆合顺序对封装效率的影响FormulationMixing order of docetaxelEncapsulationndPLGAefficiencyMean ± 5D (%>FlDocetaxel and PLGA weresHubilizW in DCM (vcrce xed)10.03 + 1.66F2Doce

23、taxel and PLGA were solubilized in DCM (sonicated)4J3 ±2.11F3PLGA was added into docexasceN DCM solution ard add DCM (vornexed)3.W± 1.73F+PLGA was added into doceuxel- DCM solution 息nd add DCM (sonicated>787S + &.I3F5D&c&tax&l-DCM solution rniMsd8.2 + 3 08with PLGA-C>

24、CH soluuon (scniciwd>药物用量的影响：表4显示初始药量对封装效率的影响。当初始载药量为25mg时，随着初始药量的增加，药物封装效率先增加后减小。多西他赛药量为10mg时，有最大封装效率。在我们的试验中，在制剂过程中初始药量增加时，有机相中的药物浓度也增加。这表明更多的药物分子可以和PLG的子相互作用，导致封装多西他赛量的增加。然而，封装量的增加与制剂中药量的增加不成比例，所 以封装效率下降。表4药物用量对纳米颗粒特性的影响Drug amauiiC (mg)PartiMd'E± 5D (nm)>pogfi&JL me&n 

25、7; SD (m¥)Encap于沁n effiienizy, mri ± SD (期)n一一52ta3! ”-177 ± ( 360 5 工 II 91 口中-64± 1 *科4 7 IS282 L 10 21 t B 7M祝 1 - 71 .!4岁7-8625IIS 311.7H B + 3 1an P超声影响程度：表1表明不同超声参数对封装效率的影响。超声时间为5分钟和10分钟时，封装效率随着超声的功率的增加而增加。然而，时间为 2分钟时，在此过程中释放更高的能量将导致封装效率的下降。 这些结果表明，超声时间为 5分钟和10分钟时，增大超声功率会增加

26、封装效率。超声时间 2分钟时，超声 功率高于70瓦则太高而无法制备稳定的纳米混悬剂。不同有机溶剂和表面活性剂的影响：图5显示多西他赛的封装效率。使用氯仿时，多西他赛的封装效率显著下降。用 TPGS®备相同的溶剂则导致最低的封装效率,使用聚乙烯醇得到最高的封装效率 Encapsulaliqn efficiency - YieldPcjhxflinar TPGS PVA PloKaTier TPGS PVAChloroformEthyl a亡电tat电(求)P至A 000000-00000 1 987654210DCM图5使用不同有机溶剂和表面活性剂的剂型的封装效率和百分率X-射线光电子

27、能谱和红外光谱分析：X-射线光电子能谱是是一种定量技术， 通过 测量聚合物基质5-10 nm深度下电子和原子的结合能，得到基本的和平均化的化 学组成。X-射线光电子能谱C1s对载多西他赛纳米颗粒表面进行封装， 并且其成 分被检测，结果展示与表5中。首先，在物理混合物的纳米颗粒中有淡信号的检 测，这可以表明多西他赛在表面上。氮信号只是在多西他赛中被发现就是多西他 赛存在于纳米颗粒表面的证据。表5表面化学的X-射线电子能光谱SurpleXPS Ulf国心* Ei疝 佟)XPS 由必厘ntal mtid 国|c-cC-0C-0X-0cNQRG烟16118U.SIB?578*12PVA)143084.

28、1必？336TPG52*4!9.lii .a70JHIDocetajcell162u447322.02S.I&ucr«e484044 +51.6那4Ptiysorjll0.5&hnk roirapirtKlcs1A7I8JkEIL4t>4.捻9Dgcctaxcl PLGA rjuiofiajixlci29317573a.i62.2(MVA多西他赛纳米颗粒的红外光谱显示在图6中。多西他赛主要的峰在 1725cm-1附近，PLGA1示特征的竣酸族基峰在1750 cm-1附近。物理混合的红外光谱检测显示了 PLGAK多西他赛的主峰。然而，在多西他赛纳米颗粒的红外光谱中

29、，多西他赛的主峰非常低。这显示PLGAffi多西他赛间的相互作用，竣酸在PLGA 和多西他赛中酯基相互作用，酯基的吸收频率相应地降低图6表面化学的傅立叶变换红外光谱在不同表面活性剂和有机溶剂条件下的体外释放：图7A显示三种多西他赛纳米颗粒体外释放动力学。对所有的表面活性剂，都能够观察到初始的爆发释放。之后，多西他赛以恒定速率释放。很明显，由TPG的泊洛沙姆188制得的纳米颗粒中多西他赛的释放速率要小于由聚乙烯醇制得的纳米颗粒的释放速度。药物的 扩散，腐蚀，聚合物的膨胀，和聚合物基体的降解是药物释放的主要机制。由于PLGA的降解速率缓慢，多西他赛从纳米颗粒中主要依靠药物扩散和基体腐蚀。在这种情况下，大小，硬度，和纳米粒孔隙度显著影响释放特性。扫描电镜观察 结果表明，所有类型的纳米颗粒都有光滑的表面， 这有利于药物缓慢释放。而且, 大小也是决定释放速率的重要因素，