质粒提取试验方案

1、卜面是实验流程和结果：感受态细胞的制备（CaCl2法）T-载体连也过程及转化挑单克隆XZ裂碱法提质粒一.感受态细胞的制备（CaCl2法）实验前的准备工作：检查准备无菌的试剂：0.1MCaCl （应提前预冷）、含10%T油的0.1MCaCl、无抗生素的LB. 1.5ml离心管 50ml离心管（6-12 个）、200ul 与 1ml枪尖（各 1 盒）。1、挑DH5酣克隆菌落至3ml无抗生素的LB中，37c摇床培养过夜（在15ml离心 管中进行）。2、1:20-50扩大培养至250ml培养体系至 OD600fc 0.6-0.8 （约3小时）3、将菌液移入冰水物后开超净台紫外，打开离心机使其预冷，30

2、分钟后分装至50ml离心管中，然后于4c下5000rpm离心5分钟；4、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，不能倒掉沉淀）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻用枪尖吹动沉淀使细胞完全悬浮，冰上放置15分钟后,4 C下 5000rpmS心5分钟（将两管合并至1管）5、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻 轻用枪尖吹动管底使细胞完全悬浮，4 C下5000rpm®心5分钟；6、弃去上清，加入15ml预冷含10%t油的0.1MCaCl,轻轻悬浮细胞，将感受态细胞悬液分装成若干份，每份50口。7、用液氮速冻，将感受态细胞置于-80

3、C保存。注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作!全过程要再冰上操作，及无菌操作！二.T-载体连接全过程及转化第一步：PCR扩增目的基因及纯化PCFT增:1. PCR反应体系：在PCR板中进行无菌水1060ulBuffer130uldNTP20ul酶25ul引物120ul引物220ul2. PCR反应条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。95 C 5min95 C145s40-60 C L 50s循环 35 次72 cJ55s72 c 10min3. PCR期间配置琼脂糖凝胶：PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。以下为PC商束以后的跑胶图:引物10引物11A引物11B引物1

4、2A弓I物12B4. PCR产物回UPPCR勺纯化（1）单一 pcfT物用氯仿法把PCR物转移至1.5ml的离心管，力口 500ul无菌水，500ul氯仿异 戊醇（24:1 ）,混匀后10000rpm离心5-10分钟转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入2 倍体积（800仙L体积即可）的无水乙醇与 NaAc的混合液。置冰上或 -80C冰箱30分钟以上。10000 rpm离心10 min。弃上清，沉淀用适量的 70%勺乙醇洗一次， 离心3min,于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉。置于恒温器上干燥（55C）至无色透明或无乙醇气味。加入40 L无菌水溶解沉淀备用,在

5、-20摄氏度保存。第二步：T-载体连接和转化1 .在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：注：T-载体试剂盒开封前要向pMD18-T Vector管中加入25 ul无菌水,同时再管上面做标记。ululul用低速离心机离心pMD18-T Vector 1.0外源DNA 1.5SolutionI 2.5用封口膜密封PCR管,2 . 16c或4c低温连接1h-2h （最好过夜）；3 .连接产物半量（2.5ul ）加入50 ul的DH5 a感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置30min； DH5 a感受态细胞加 5 ul 0.1M的无菌氯化钙做阴性对照；4 .热击：42c水浴中热击90秒（注：精确计算时间

6、，过长将对细胞 造成伤害），热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。5 .复苏：向每管中加入预冷的400“LB培养基（注：不含Amp）,混 匀后37c轻摇培养11.5小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达 质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。6 .涂布平板筛选转化质粒：将上述各管培养液摇匀后取100 l分别涂布于含Am的筛选L坪板上。（注：1.将培养液摇匀后涂布， 并要把平板涂干。）正面向上放置15分钟，待菌液完全被培养基 吸收后倒置培养皿，37 C培养过夜。7 .次日（12-14小时后）观察和从平板上挑取单克隆于甘油LB中（10-20% 甘油），每个平板挑3个单克隆，-20 C保存。三

7、.挑单克隆选取平板中的单克隆菌落用枪尖挑取两个分别带枪尖打入15ml的离心管中（含3ml带Amp的LB）摇床培养过夜以备提取质粒用。四.裂碱法提质粒1 .将15ml离心管中的菌液分两组于1.5ml离心管，一组加1.5ml的菌液离 心提质粒，另一组加300ul的80%勺甘油+1ml的菌液-20摄氏度保存。2 .次日将培养的菌液10000 rpm离心3min,弃上清。3、加入1150仙L?容液I振荡使菌体沉淀充分悬浮（用枪尖吹起），务必悬浮 充分。4、加入200 pL溶液H （现用现配），立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。可观察到原浑浊的菌悬浮液变清变粘，放置时间不能超过3min。5、加入150 pL

8、预冷的溶液田，立即上下颠倒充分混匀7-10次，不宜太剧烈。 可观察到白色片状沉淀出现。6、置冰浴10 min,也可置于一20c中5 min。7、10000 rpm 离心 8-10 min 。8、在离心过程中可取未灭菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入等体积（400pL 即可）酚-氯仿-异戊醇（ 25:24:1 ）备用，取灭菌的新1.5 mL的Eppendorf 管，加入2倍体积（ 800 M体积即可）的无水乙醇与 40ul3MNaA品用。9、离心完将上清迅速倒入已加的酚-氯仿-异戊醇中，充分混匀。小心不要将 白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中。10、10000 rpm 离心 10 min。11、吸水相，加入已加好的无水乙醇中，颠倒混匀几次（小心不要吸入酚相， 没把握时宁可放弃一些水相）。置冰上或-80C冰箱30分钟以上。12、10000 rpm 离心 10 min。13、迅速弃上清，沉淀用适量的 70%勺乙醇洗一次，于纸