助孕胶囊对多囊卵巢大鼠血清性激素及卵巢肿瘤坏死因子α表达的影响

1、助孕胶囊对多囊卵巢大鼠血清性激素及卵巢肿瘤坏死因子表达的影响 作者：刘艳巧，党慧敏，刘润侠，康晓玲【摘要】 目的 观察助孕胶囊对多囊卵巢（PCO）大鼠生殖内分泌激素、卵巢组织肿瘤坏死因子表达的影响，探讨其对PCO模型大鼠可能的作用机制。方法 采用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素（HCG）造模法制备PCO模型大鼠。随机分为对照组、PCO模型组（模型组）、PCO模型组+助孕胶囊组（中药组）、PCO模型组+克罗米酚组（西药组），运用放免法测定血清性激素水平的变化；光镜观察卵巢、卵泡发育的影响，免疫组化学法检测卵巢组织肿瘤坏死因子表达水平。结果 助孕胶囊可使PCO大鼠的颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄，血

2、清、LH水平均明显下降，并下调卵巢组织肿瘤坏死因子的表达。结论 助孕胶囊能够通过调整内分泌及影响卵巢肿瘤坏死因子的表达，在中枢及卵巢局部协调发挥作用，从而调整性腺功能，促进卵泡的发育成熟及排卵。 【关键词】 多囊卵巢综合征；助孕胶囊；性激素；肿瘤坏死因子；大鼠；紫河车；仙灵脾 To observe the effect of Zhuyun capsule(ZYC) on expression of genital endocrine hormone and tumor necrosis factor-alpha(TNF-) in PCO rats, and investigate therap

3、eutic actions and possible therapeutic mechanism of the capsule. Methods The PCO rat models, prepared by pregnancy hormone combine with human chorionic gonadotrophin(HCG), randomly divided into four group as control, model, Chinese crude drug(CCDG) and western medicine group(WMG); The levels of seru

4、m gonadal hormone were detected by radioimmunoassay; The effects of ZYC on ovaries and ovarial follicular development were observed by light microscope; And the expression level of TNF- was detected with the immunohistochemical staining technique. Results ZYC could increase the thickness of granular

5、 cell layer and decrease the thickness of theca cell layer, greatly decrease the level of T and LH in serum and the expression of TNF- in rat ovary. Conclusion ZYC can function regulating the endocrine and affecting the expression of the TNF- coherently in center and ovary to adjust genital gland an

6、d promote the mature and ovulation of follicular. polycystic ovarian syndrome; Zhuyun capsule; gonadal hormone; TNF-; rats; placenta hominis; Herba Epimedii 多囊卵巢综合征（PCOS）是一组发病多因性、临床表现多态性的综合征，以雄激素过多和持续性无排卵为临床特征。中药调经促排卵临床疗效确切，助孕胶囊为临床经验方，对PCOS、各种无排卵及排卵障碍导致的月经不调、不孕不育有较好的疗效。本试验通过建立PCOS大鼠模型，研究助孕胶囊对PCOS大鼠性

7、激素水平、卵巢卵泡发育及TNF-表达的影响, 现从分子生物学水平及卵巢局部分析其可能的作用机制，为中药调经助孕提供科学的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1 动物 健康SD雌性大鼠，24 d龄，体质量50 g左右，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。 1.1.2 药物 中药助孕胶囊由西安交通大学医学院第二附属医院中药制剂室提供药物，0.4 g/胶囊，1 g胶囊含生药1.575 g；克罗米酚（CC）由上海衡山药业有限公司生产，产品批号040301，50 mg/粒。 1.2 方法 1.2.1 模型制备 参照K.Bogovich1、朱辉等2的方法，选用24 d龄未成年雌性SD大鼠, 皮下埋

8、植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(3 mm), 在27 d龄时每日2次皮下注射1.5 IU HCG, 正常对照组每日2次皮下注射注射用水，共注射9 d。37 d龄连续阴道细胞涂片2个性周期。采血,测雄激素（T）、胰岛素（INS）水平。观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定,符合标准者作为PCOS大鼠模型,不符合者剔除。对照组连续阴道细胞涂片2个性周期全部呈现完整的动情周期,血清T、INS测定在正常范围。 1.2.2 动物分组 共分4组，正常对照组10只。PCO模型自47 d龄起，称体质量，分组观察。将30只模型大鼠随机分为模型组、助孕胶囊组（简称中药组）、CC组（简称西药组），每组10

9、只。 1.2.3 给药方法 中药组按助孕胶囊生药6 g/（kgd），西药组按人与大鼠公斤体质量折算系数给药，剂量20 mg/（kgd）。对照组和模型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水1 mL/100 g体质量，各组1次/d，共14 d。 1.2.4 血清学测定 末次给药后24 h，2%戊巴比妥钠0.3 mL腹腔麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血,离心、分离血清, 采用放射免疫法检测血清性激素(FSH、LH、E2、T)水平，由西安交通大学第二医院放免检验科按操作程序测定,批内批间误差<10%。性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。 1.2.5 病理形态学观察 双侧卵巢大体解剖观察，并取下

10、双侧卵巢组织、用10%的甲醛液固定，常规石蜡包埋、切片，待做HE染色及免疫组织化学分析，光镜观察卵巢的组织形态改变、卵泡的大小发育情况。 1.2.6 TNF-表达的SP免疫组化染色 应用免疫组化SP法检测卵巢组织LIF表达。SP试剂盒和LIF单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，应用DAB显色，均进行抗原修复、HE染色，切片厚4 mm，并行阴性和阳性对照。免疫组化结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞膜周围。对综合染色强度和分布范围进行半定量评分，评分标准：阴性为0分；染色弱但明显强于阴性对照者为1分；染色清晰者为2分；染色强者为3分。阳性细胞数者为0分；<10%为1分；20%

11、30%为2分;>30%为3分。上述两种评分相加为表达强度评分。 1.3 统计学分析 所有数据均以均数标准差（）表示，各测量值间的比较用方差分析。 2 结果 2.1 助孕胶囊对大鼠卵巢发育形态学的影响 对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，初级卵泡位于浅层，数目较多，体积小，呈圆形或椭圆形。生长卵泡大小不一，位置较深，成熟卵泡多位于浅表部，可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构。颗粒细胞呈多层(多为68层)，形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列；模型组镜下见卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，后者常发生黄素化，卵巢皮质间质细胞明显增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢；西药组在镜下仍可见黄素化的膜

12、细胞层增加，卵巢皮质间质细胞增生，同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡，颗粒细胞层数增加，泡膜细胞层变薄，黄体组织数量较模型组明显增多；中药组镜下可见皮质内大多数卵泡为正常发育的卵泡，有初级卵泡、生长卵泡及成熟卵泡；颗粒细胞层数明显增加，约为45层，形态完整，排列整齐；泡膜细胞层明显变薄，黄体组织数量较模型组明显增多。 2.2 助孕胶囊对大鼠性激素的影响 模型组T、LH水平高于对照组，而FSH、E2水平明显低于对照组，符合PCOS内分泌紊乱的表现特征。中药组大鼠血清T、LH水平明显低于模型组，而FSH、E2水平高于模型组，均具有显著性差异(P<0.05)；西药组大鼠血清

13、E2、FSH水平亦显著高于模型组(P<0.05)，而西药组大鼠血清T、LH水平与模型组之间相比则无显著性差异(P>0.05)；与西药组相比，中药组T、LH水平明显降低(P<0.05)，而FSH、E2水平两组之间无显著性差异(P>0.05)。见表1。 2.3 卵巢组织TNF-表达的变化 研究结果显示，TNF-主要表达在卵巢颗粒细胞，卵泡膜细胞亦有表达。模型组大鼠卵巢TNF-表达水平明显升高，与对照组比较差异非常显著(P<0.05)；中药组大鼠卵巢TNF-表达水平相比模型组明显下降(P<0.05)；西药组大鼠卵巢TNF-表达水平较模型组有所下降(P>0.0

14、5)；中药组与西药组之间相比，TNF-表达水平明显降低(P<0.05)。见表1及图1。 3 讨论 多囊卵巢综合征(PCOS)是妇科内分泌系统最常见的疾病，占育龄妇女的5%10%1，以双侧卵巢呈多囊性改变，伴不孕、多毛、痤疮、肥胖、月经紊乱等的特点的一组疾病。采用孕激素联合HCG的造模方法2，基本原理在于皮埋左旋18-甲基炔诺酮可使E2、P、FSH、LH均呈现低水平,导致不排卵。而HCG在卵泡早期使用可致卵泡闭锁，从而形成多囊卵巢综合征。本实验结果表明：造模后的大鼠卵巢体积增大，镜下可见颗粒细胞层变薄甚至消失，颗粒细胞排列疏松，膜间质细胞增生，其中可见散在丛状的黄素化细胞巢。说明孕激素联合

15、HCG能够诱发卵巢卵泡发生闭锁及无优势卵泡产生；造模后的大鼠血T水平明显地高于对照组(P<0.05)。说明本实验所采用的动物模型无论是病理形态学变化还是激素水平均与PCOS非常相似。 正常妇女卵泡发育经历募集、选择、优势化及排卵等一系列生理过程。并且卵泡中只有一部分被募集并选择最后有一个发育成优势卵泡而排卵3。PCOS患者生殖功能障碍的主要特征是卵泡发育障碍和无排卵，高雄激素血症是PCOS的基本病理生理改变之一。本研究中PCO 模型大鼠血T水平显著高于对照组，而中药组大鼠血清T水平明显低于模型组，西药组大鼠血清T水平与模型组之间相比则无统计学意义，说明助孕胶囊相比CC，能显著降低血清T水

16、平，可以有效调节PCO大鼠T的代谢紊乱。其机理可能为以下几个方面：通过使卵泡内合成雌激素的颗粒细胞层变厚，合成雄激素的卵泡膜细胞层变薄，从而降低多囊卵巢大鼠雄激素水平的同时提高雌激素水平，进而促使卵巢排卵。直接降低雄激素水平。已有研究证明方中的白芍能有效降低血中T浓度，改善排卵状态，其作用机制在于直接抑制卵巢和肾上腺分泌T，而且不影响垂体分泌LH和FSH4；而CC为人工合成的非甾体制剂具有较强的抗雌激素效应和较弱的雌激素作用，本研究结果表明，相比助孕胶囊，其不能明显降低血清T水平，故无抗雄性化的作用。 已知PCOS另一个重要的病理特征是垂体促性腺激素分泌的不协调，即LH明显高于FSH，LH/F

17、SH>23，并缺乏排卵前LH峰。实验结果表明，PCO模型大鼠血清LH、LH/FSH水平显著高于对照组，而中药组其水平明显降低，说明助孕胶囊能明显降低PCO大鼠的LH、LH/FSH水平，从而促使建立正常的反馈作用，恢复性腺的正常调节。其作用途径可能为：方中的补肾中药能在多个环节调节性腺轴的功能，其中包括调节下丘脑GnRH的分泌、垂体LH，FSH的释放、卵巢性激素的合成和分泌，并可调节垂体对 LH-RH的敏感性、卵巢对LH的反应性及卵巢受体的形成6；方中的温补肾阳中药亦能促进卵泡发育和排出，提高血浆E2水平，宫颈黏液呈不同程度的增加7。动物实验亦证明助阳补肾中药可以增强性腺轴的功能。 TNF

18、-通过受体介导，以自分泌、旁分泌及远距离作用形式参与调节内分泌系统的功能，前人的实验都证明TNF-能够影响生殖激素的释放，调节甾体激素分泌并刺激细胞分化8，并能抑制颗粒细胞孕酮和雌激素的分泌。结合本实验结果可推测，既然TNF-表达于大鼠卵巢中，内膜细胞及颗粒细胞上很可能含有内源性TNF-受体，通过与其受体特异性结合，诱导靶细胞产生神经酰胺这种第二信使，从而抑制P、E2的分泌9-10。同时本实验研究表明，PCO大鼠卵巢TNF-表达明显高于正常大鼠，表明过多的TNF-可能通过上述机制抑制卵巢颗粒细胞P、E2的分泌，进而影响卵泡发育；PCO大鼠卵巢TNF-过多的表达，还能促进大鼠颗粒细胞的PAI-1

19、活性增强，消弱t-PA的作用，从而使卵泡壁胶原分解受到抑制，进而抑制排卵；从本实验结果分析，助孕胶囊相比CC，能够显著降低PCO大鼠卵巢颗粒细胞TNF-表达，最终促使排卵的发生，结合以往研究及本实验研究结果，分析其可能的作用机制为：通过抑制PCO大鼠卵巢颗粒细胞TNF-表达，进而解除其对卵泡类固醇激素分泌的抑制作用，从而使卵巢P、E2的分泌增加，促进卵泡的发育及成熟；通过减少TNF-在颗粒细胞中的表达，抑制颗粒细胞PAI-1的活性，促进卵泡壁胶原的分解，诱导排卵的发生。 PCOS属中医学“不孕”、“闭经”、“崩漏”、“癥瘕”范畴。其病机与肝、肾、脾三脏功能失调及痰、湿、气、血的瘀滞密切相关。本

20、方由紫河车、鹿角胶、仙灵脾、半夏、天南星、熟地、女贞子、旱莲草、当归、芍药、桃仁、红花、香附等中药组成。方中以紫河车、鹿角胶、仙灵脾补肾助阳、益精添髓；半夏、天南星燥湿化痰、消痞散结；女贞子、墨旱莲、熟地补肝肾之阴、益精血与补肾阳药同用，取其肾中阴阳互相依存，又互相转化，从而促进卵泡的成熟；中医理论认为卵泡的发育、排出除依赖肾气旺盛之外，还离不开肝之疏泄，加以不孕患者多精神紧张，盼子心切，故常兼见肝气郁结，而女子又以血为用，月经、胎孕均以血为主，故配以当归、芍药以养血柔肝；桃仁、红花活血通经，行气祛瘀以促肾中阴阳气血转化，使阳气渐旺，促使成熟的卵泡排出；香附与桃仁、红花合用，以理气活血、祛瘀软

21、坚。全方配伍具有补肾祛痰，活血化瘀之功，药后则痰瘀去，经脉通，气血畅，月事下，达到恢复排卵的目的。 本实验研究了助孕胶囊对PCO大鼠卵巢卵泡发育、血清性激素水平及卵巢组织TNF-表达水平的影响,其结果提示助孕胶囊可使PCO大鼠的卵巢颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄，血清、LH及卵巢组织中TNF-的表达水平均明显下降，从而恢复排卵。为中药治疗多囊卵巢综合征不孕提供实验依据的同时也为中医痰湿血瘀症本质的探讨提供了新的思路。【参考文献】 1 K Bogovich. Induction of ovarian cysts in progesterone synchronized immature rats:evidence that suppression of follicular aromatase activity is not a prerequisite for the induction of cystic folliclesJ. Endocrinology 1989, 124(4)：1 646-1 653. 2 朱 辉,倪 江,姚兰春，等.大鼠多囊卵巢动物模型的实验研究J.哈尔滨医科大学学报,1999,33(3):187-188.