啤酒酵母蔗糖酶的提取、纯化及测定研究

1、浙江工业大学海洋学院生物化学实验论文专业：食 品 科 学 与 工程 班级：食 品1201 姓名：徐 素 媛啤酒酵母蔗糖酶的提纯及相关性质测定研究作者：徐素媛 单位：浙江工业大学海洋学院食工1201班摘要：为了了解酶的提取及及初提纯方法，并在此基础上掌握Q Sepharose-柱层析法提纯酶、DNS法测定酶活力、Folin-酚法和微量凯式定氮法测定蛋白含量以及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和方法，需要进行一系列的实验，主要实验过程如下：啤酒酵母自溶后经多次分别离心得到初提液A、热提取液B和乙醇提取液C。利用Q Sepharose-柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液，通过测定洗脱液的吸光值

2、及酶活力的定性测定，选取活力最高的洗脱液得到柱分离液D。接着进行定量酶活力测定，根据葡萄糖标准曲线的方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率，并得出随着蔗糖酶的不断提纯，酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并得出A、B、C、D4个样品的比活力在一步步的纯化中逐渐升高，纯化倍数也明显增大，而总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离来间接测定蔗糖酶的相对分子质量。关键词：蔗糖酶 提

3、纯 酶活力 Folin-酚法 微量凯式定氮法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法正文：1、文献综述1.1 总述啤酒酵母也叫营养酵母，为酵母科、酿酒酵母属，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、细胞色素c等营养物质1从啤酒酵母中提取蔗糖酶的一般工艺过程包括提取和分离纯化以及相关性质测定2。1.2 蔗糖酶的提取蔗糖酶(Sucrase，EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于-1，2糖苷键，并将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的-D-呋喃果糖苷酶（-D-frutofuranosidases, EC 3.2

4、.1.26）和从葡萄糖末端切开蔗糖的-D-葡萄糖苷酶（-D-glucosidases, EC3.2.1.20）。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取3。酵母蔗糖酶的提取可采用酵母自溶法、冻融法和SDS抽提法，用不同提取方法所得蔗糖酶的活性不同，实验研究表明，SDS抽提法的酶活性最高，冻融法次之，常规的甲苯自溶法酶活性最低。SDS抽提法提取效率最高最高，还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产4。1.2 蔗糖酶的纯化1.2.1 初步纯化蔗糖酶的初步纯化一般采用热提取法、乙醇沉淀提取法，并在此过程中应用离心的方法，得到蔗糖酶的初提取液。

5、1.2.2 离子交换层析法离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术，蛋白质的两性特征意味着它们可以依pH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在。其等电点决定了所用介质的pH值及所选离子交换剂的类型。蔗糖酶的等电点在酸性，在pH=7.3条件下选择阴离子交换剂。蛋白质与离子交换剂之间结合的强度取决于蛋白质上共同发挥作用的离子基团数目、离子交换剂上电荷的密度以及流动相的离子强度。因此，蛋白质的洗脱可用离子强度递增的梯度方式进行，也可用pH梯度方式进行。由于pH的变化可能导致酶的失活，故一般用离子强度递增的方法来纯化酶。提高分离效果的实验条件选择可以从以下三方面考虑：（1）离子交换剂类型的选择；（2）洗脱液

6、pH选择；（3）洗脱液的离子强度的选择。通过实验，比较DEAE-纤维素层析法、DEAE Sepharose层析法和Q Sepharose层析法，得出采用DEAE-纤维素层析法的结果是穿透峰大，且穿透峰的酶活很大，说明纤维素吸附蔗糖酶的量很少，即介质载量低,柱容量低，导致回收率低。由于穿透峰大，得到的洗脱峰很小，且酶活也很低，有时测得的酶活峰不在蛋白峰上，达不到实验效果，通过比较最终得出Q Sepharose层析法的效果最好，其具有如下特点：（1）提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高，分离纯化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高，回收率高，蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离，提高纯度，真正体现

7、离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性。（2）缩短实验时间。梯度洗脱时间大大减少。（3）节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变，不能承受0.1M以上NaOH清洗，重生效果差，寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性，且其化学稳定性极高，不易破碎，可以承受1MNaOH的清洗，重生效果好，可以使用数百至上千次，因而降低了成本5。1.3 酶活力测定法测定酶活力的方法多种多样，包括还原法、色原底物法、粘度法、HPLC法（高压液相色谱法）、免疫学方法，其中还原法是指酶与底物在特定的条件（温度、值、底物浓度等）下反应，酶可以促使底物释放出还原性的基团。

8、在此反应体系中添加化学试剂，酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应，生成有色物质。通过在特定的波长下比色，即可求出还原产物的含量，从而计算出酶活力的大小。目前常用的还原法有：DNS法、砷钼酸盐法、酚硫酸法和地衣酚法。这些方法各有特点，应用的范围也不尽相同。DNS法和砷钼酸盐法主要用于木聚糖酶、-葡聚糖酶和纤维素酶的活力测定，砷钼酸盐法较DNS法更为适合微量测定；酚硫酸法测定的是全糖而非还原性的糖，因此该法不适于测定NSP酶类；地衣酚法用于测定戊糖，虽然灵敏性好，但因试剂昂贵等原因较少应用6。本实验采用的是DNS法。1.4 蛋白质浓度测定蛋白质含量测定的方法有考马斯亮蓝法、紫外分光光度法、Foli

9、n-酚法及双缩脲试剂法，本实验采用Folin-酚法，Folin-酚法又称Lowry法，首先在碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这种深蓝色的复合物在750nm和660nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的浓度7。1.5 蛋白质分子量测定蛋白质分子量的测定方法有多种，如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶色谱法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法等，目前在实验室中应用较多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳法，另外近年来发展较快的质谱技术也可测定生物大分子物质的质量，其灵敏度和准确度为各种方法之

10、首，电喷雾质谱法是目前测定蛋白质分子质量最准确地方法之一，其系统误差非常小，但质谱仪价格昂贵，不宜做常规分析手段8。2、实验研究过程2.1 蔗糖酶的提取及初提纯2.1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。酵母经自溶破碎细胞壁后，经菌体分离提取蔗糖酶液，再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。2.1.2材料与方法2.1.2.1材料2.1.2.1.1试剂 新鲜的啤酒酵母；  醋酸钠（AR）； 甲苯（AR）； 4mol/L醋酸；  95%乙醇

11、（<-20）；  0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。  0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。  注：整个实验要注意避免高

12、温，以防止酶失活。2.1.2.1.2器材 锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；  量筒10ml（×1），25ml（×1）;  烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；  具塞试管10 ml（×3）；  吸球、玻棒、滴管、pH试纸；  培养箱；  恒温水浴箱；  磁力搅拌器或梯度混合器，搅拌子； 高速冷冻离心机。 2.1.2.2 实验方法 细胞破碎的方法：化学裂解法  离心分离法 热提取液B：等电沉淀

13、法2.1.3 操作过程 1、酵母的自溶 2、初提液A：在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，经离心等操作后取上清液记体积为VA=19.5ml。 3、热提取液B：VB=15.0ml 4、乙醇沉淀提取液C：将热提取液B倒入100ml烧杯中，把烧杯放入冰浴中轻轻搅拌并慢慢加入（20）95%乙醇溶液，35min后继续搅拌5min，离心，用5ml 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体再一次离心，取上层清液，记体积为VC=6.2ml。2.1.4 结果与讨论2.1.4.1 结果 VA总=VA=19.5ml  VB总=

14、VB·VA/(VA-3)=17.7ml  VC总=VC·VA/(VA-3) ·VB/(VB-3)=VC·VB总/(VB-3)=9.1ml2.1.4.2 讨论 1、恒温水浴后，因设备原因未能及时取得足够的冰块，没能及时冷却，使得杂蛋白不能完全冷却变性析出，造成提取液纯度降低。 2、乙醇沉淀提取液C时，乙醇溶液的滴加速度稍快，且搅拌时间的缩短造成提取液C的浓度降低。2.1.5 结论 本实验将20g鲜酵母通过化学裂解法使其自溶对蔗糖酶进行初提纯，得到初提液A19.5ml（3ml保存），热提取液B15ml（3ml保存），乙醇沉淀提取液6.2m

15、l（全部保存）。2.2 蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱层析法2.2.1 实验原理 层析是利用不同物质的理化性质不同（吸附能力、分子形状、分子大小、极性、亲和力、分配系数）而建立起来的计数，所有层析系统都由固定相和流动相组成，混合物经过两相与其作用，最终分离。 离子交换层析原理：是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 本法用的Q Sepharose-凝胶是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型基团，为强阴离子交换剂。Q Sepharose-凝胶

16、交换介质载量高，分辨率高，能承受较高的流速，化学稳定性好。在pH7左右时，Q Sepharose-凝胶带正电，而一般蛋白质在此酸度范围内带负电，两者可结合，降低pH或提高例子强度均可使之脱下来，当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，达到分离的目的。2.2.2 材料与方法2.2.2.1材料2.2.2.1.1试剂 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；  1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；  0.5mol/LNaOH；  Q 

17、Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4保存。  注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。 2.2.2.1.2 器材      层析柱；  梯度混合器及搅拌子;  紫外分光光度计；  点滴板；  尿糖试纸、擦镜纸；  止水夹； 烧杯、试管。   2.2.2.2 实验方法      离子交换Q Sepharose-柱层析法  梯度洗脱法2.2.3操作过程 1、离子交换

18、柱的填充  将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。     2、缓冲液盐度梯度发生器的安装 在低离子强度溶液的杯中加入一颗搅拌子，且要形成梯度。 3、柱的平衡  将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平 衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。  4、加样  缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一。 5、洗脱  用25ml 0.05mol/L

19、 Tris-HCl pH7.3缓冲溶液洗穿透峰，接着连接梯度发生器，进行线性梯度洗脱，流出液进行收集，每管接3ml。6、测OD值  在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下：表2-1试管号OD值试管号OD值10.021140.27020.468150.63730.082160.55840.030170.20150.021182.52660.005190.38370.003200.33680.040211.08490.058220.586100.081230.353112.464240.099120.057250.067130.037

20、7、酶活力测试 用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上测出的OD值，取11、18、21管得到柱分离液D。 酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。用“+”的数目表示酶活力的大小。  最后得VD=8.05ml2.2.4 结果与讨论2.2.4.1 结果 VD =8.05ml      VD总=VD·VC总/V样=8.05×9.1/0.5=146.51ml。由数据制图如下：图2-1 Q Sepharos

21、e-柱层析法纯化蔗糖酶数据处理结果表2.2.4.2 讨论 1、由于层析柱出现问题，液体无法顺利流下，洗脱时不能控制洗脱速度，影响柱层析效果。 2、由图可以看出梯度洗脱时出现3个较高的峰值，因此收集这3支试管的洗脱液得到柱分离液D。 3、Q Sepharose-柱层析法的实验效果较好，琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。2.2.5 结论 通过Q Sepharose-柱层析法对蔗糖酶进行纯化，得到柱分离液D 8.05ml，并计算得VD总=146.51

22、ml。2.3 蔗糖酶活力的测定2.3.1实验原理 酶的活力大小通常是以该酶在最适pH、温度等条件下催化底物水解，经一定时间后，以反应物中底物的减少或产物形成的量来表示的，蔗糖酶能水解蔗糖成果糖和葡萄糖两种还原糖，可以用测还原糖（葡萄糖和果糖）的量来计算酶的活力。还原糖的测定方法有费林试剂法、3，5-二硝基水杨酸法、Nelson试剂法。本法采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖的量。其原理为，在过量的碱性溶液中，DNS与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，该化合物在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的量。2

23、.3.2材料与方法2.3.2.1材料2.3.2.1.1试剂 （1）3,5-二硝基水杨酸  甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。          乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。           将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中

24、备用，在室温放置710天后使用。  （2）葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）  准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。 （3）0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液 溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L。 （4） 5%蔗糖  用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置。  （5） 2mol/L NaOH  溶解0.80

25、g氢氧化钠于10ml水中。2.3.2.1.2器材 电炉；  恒温水浴;  紫外分光光度计；  试管、吸管； 2.3.2.2 实验方法 DNS法测定还原糖的量 紫外分光光度法 稀释法2.3.3 操作过程 1、葡萄糖标准曲线的制作 取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴中加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。表3-1 葡萄糖标准曲线的制作试管号012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸馏水3.002.202.001.801.601

26、.40DNS1.501.501.501.501.501.50总体积4.504.504.504.504.504.50 2、酶活力的测定 将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：10）。  取8支试管，按表3-2加入各种试剂。表3-2 酶的催化反应项 目A（1:200）B（1:200）D（1:200）D（1:10）加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml2.002.002.002.002.002.002.002.002mol/LNaOH/ml0.500.500.500.5035预

27、热10min5%蔗糖(35)/ml2.002.002.002.002.002.002.002.00加入蔗糖，立即摇匀开始计时，35准确反应3min2mol/LNaOH/ml0.500.500.500.50总体积/ml4.504.504.504.504.504.504.504.50 按表3-3取分别取反应液进行还原糖的测定，方法与1所述相同。表3-3反应液还原糖测定项目A对A样B对B样C对C样D对D样V测/ml0.100.100.100.100.150.150.200.20蒸馏水/ml2.902.902.902.902.852.852.802.80DNS/ml1.501.501.501.501.

28、501.501.501.50总体积/ml4.504.504.504.504.504.504.504.50 测得OD结果如表3-4所示：表3-4 反应液还原糖测定结果反应液A对A样B对B样C对C样D对D样OD值00.52800.42500.77500.379 计算酶的活力单位数及酶的回收率 总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n  酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）·100%2.3.4 结果与讨论2.3.4.1 结果 1、根据测得的数据绘得葡萄糖标准曲线如图3-1所示：图3-1 葡萄糖标准曲线 2、根据葡萄糖标准曲线方程

29、y=3.275x-0.2918，计算得V测体积测出的葡萄糖毫克数，最终计算结果如表3-5所示：表3-5 蔗糖酶活力测定结果项目初提液A热提取液B乙醇提取液C柱分离液D总活力单位数/U219381744389003378回收率/%10079.5140.5115.402.3.4.2 讨论 1、葡萄糖标准曲线测定所得的数据不是很标准，第二个数据不在线性方程上，线性不是很好，但总体符合要求。 2、由实验数据处理结果得，随着蔗糖酶的不断提纯，酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。2.3.5 结论 根据测得的实验数据并计算得初提液A的酶总活力单位数为21398U，热提取液B的酶总活力单位数为17443U，

30、回收率为79.51%，乙醇提取液C的酶总活力单位数为8900U，回收率为40.51%，柱分离液D的酶总活力单位数为3378U，回收率为15.40%，由此可以得出， 随着蔗糖酶的不断提纯，酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。2.4 蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算2.4.1实验原理本法（Folin-Lowry）中所用的福林-酚试剂（Folin-Ciocalte试剂）中的主要成分磷钼酸、磷钨酸（均黄色俗称磷钼黄，磷钨黄），可被蛋白质分子中的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）还原生成蓝色化合物磷钼蓝。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750和660nm有较强的光吸收能力。故可用比色法测定

31、已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未知样品的蛋白质浓度。本法极为灵敏，可测定范围为25250g；缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格。而且不同的蛋白质因Tyr和Trp含量不同，显色程度也有差异。该方法对蛋白质含量的一系列变化，如蛋白质提纯过程的过程颇为有用。2.4.2材料与方法2.4.2.1材料2.4.2.1.1试剂 试剂A（碱性铜试剂）  取Na2CO3（AR）10g和 NaOH（AR）2g，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠 （Na2C2H3O32H2O，AR）0.1g和CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水

32、微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24至少可使用1个月。 试剂B（酚试剂）  在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟

33、，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。  标准浓度牛血清白蛋白溶液（200g/ml）  精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。2.4.2.1.2 器材 分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；  刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5

34、ml（×1）； 试管1.5 cm×15cm（×8）；      恒温水浴箱（55） 2.4.2.2 实验方法 Folin-酚法 稀释法 紫外分光光度法2.4.3 操作过程 1、标准曲线的绘制 按表4-1加入各试液，试剂A加毕混匀后，静置10min，再加入试剂B放置10min，再加第二次，每加一次都立即迅速充分混匀，加一管摇一管，全部加毕后，置55恒温箱保温5min，取出试管冷却，660nm处测定各管OD值，以牛血清蛋白微克数为横坐标，OD660值为纵坐标，绘制标准曲线。表4-1 标准曲线配制加样表 试剂量

35、/ml所加试剂试管号012345标准牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0H2O/ml4.54.34.13.93.73.5试剂A/ml1.01.01.01.01.01.0试剂B/ml第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积/ml6.06.06.06.06.06.0OD6600.0000.1750.3220.4420.5810.641 2、未知蛋白浓度的测定 将前面所得的四部分提取液按比例稀释，初提取液A（1：100）；热提取液B(1:100)；乙醇提取液C（1：20）；柱分离液D不稀释，A、B、C的稀释液各取0.5ml，D取3ml，

36、进行蛋白质含量测定，方法同1。测得OD值如表4-2所示：表4-2 未知蛋白浓度OD660值试管号A0A1B1C0C1D0D1OD660值0.0000.2730.2480.0000.2150.0000.361 2.4.4 结果与讨论2.4.4.1 结果 1、牛血清蛋白标准曲线如图4-1所示图4-1 牛血清蛋白标准曲线 2、根据测得的数据及牛血清蛋白标准曲线方程y=0.003x+0.0749，计算得实验结果如表4-3所示：表4-3 各提取液酶活力等比较总体积/ml总酶活/U总蛋白/mg比活力(U/mg)蛋白回收率/%酶活回收率/%纯化倍数/倍初提液A19.521938257.485.23热提取液B

37、17.717443205.384.9679.7679.510.997乙醇提取液C9.1890017.1520.476.6440.516.12柱分离液D46.5133784.6734.351.7915.408.62 2.4.4.2 讨论 1、A、B、C、D的总蛋白含量与总酶活都逐渐降低，但比活力总体都逐渐增大，纯化倍数也逐渐提高，同时蛋白质回收率和酶回收率都逐渐下降，上述这些表现是因为蛋白质在一步步的分离纯化过程中有所损失，但杂蛋白和其他非蛋白杂质都被逐渐除去，所以比活力和纯化倍数都逐渐增大，因此C、D的总蛋白很少，但纯度很高，因而比活力比A、B大得多。 2、分析比较A、B、C、D的每一组数据可

38、以发现，A与B的数值比较接近，且与C和D的相差较大，这是因为初提液A和热提取液B只经过热溶解和离心提取，纯化程度不高，而C与D的比活力和纯化倍数的差距也较大，说明柱层析后的D比C有更大的酶活，虽然有损失，但纯化程度提高不少，可见柱层析法是一种比较有效的纯化方法。2.4.5 结论 1、实验结果如表4-4所示： 表4-4 实验结果记录表总蛋白/mg比活力(U/mg)初提液A257.485.23热提取液B205.384.96乙醇提取液C17.1520.47柱分离液D4.6734.35 2、A、B、C、D的比活力在一步步的纯化中逐渐提高，纯化倍数也明显增大。2.5 微量凯氏定氮法测总蛋白氮2.5.1实

39、验原理 样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵，然后经强碱碱化使硫酸铵分解释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度即可计算得样品的含氮量。2.5.2材料与方法2.5.2.1材料2.5.2.1.1试剂 蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml。  浓硫酸 硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合研磨成粉末。   30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。   2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml。  混合指示剂：01甲基红酒精溶液和 01

40、甲基蓝酒精溶液临时按2:1的比例混合。或01甲基红酒精溶液和 01溴甲酚绿酒精溶液临时按1:5的比例混合。 0.01mol/LHCL标准溶液2.5.2.1.2器材 改良式凯氏定氮仪 克氏烧瓶50ml（×2）;  容量瓶50ml（×1）；  锥形瓶50ml（×3）；  吸球、移液管、玻棒、滴管、量筒。2.5.2.2 实验方法 微量凯氏定氮法  滴定法2.5.3 操作过程 1、消化 取50ml克氏烧瓶，加0.1ml热提取液B，硫酸钾-硫酸铜混合物约20mg以及浓硫酸2ml，消化至透明并呈淡绿色，定容至50ml。 2、洗

41、涤定氮仪 3、蒸馏 加5ml消化液，蒸馏至酸液由葡萄紫色变成绿色后，再蒸馏3min，降低锥形瓶，再蒸馏1min。重复3次。 4、滴定 用0.01mol/LHCL溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至淡葡萄紫色，3次蒸馏所耗HCL体积分别为1.22ml，1.20ml，1.10ml。2.5.4 结果与讨论2.5.4.1 结果 滴定时所耗HCL溶液量分别为1.22ml，1.20ml，1.10ml，取平均值1.17ml，即A=1.17ml，则样品含氮量（mg/ml）=（A-B）×N×14.008×V2/（V1×V3）=17.21mg/ml（B=0，N=0.0105mol/L

42、，V1=0.1ml，V2=50ml，V3=5ml）所以 样品蛋白质含量=17.21×6.25=107.56mg/ml2.5.4.2 讨论 1、在做消化步骤时，结果溶液并未变成透明的淡绿色，而是褐色，本步骤失败，因此借用了其他组的消化液，可能的原因是加试剂时出现差错或加热的获利过大，样品被浓硫酸氧化过度，所以为褐色。 2、本实验可能存在的误差：蒸汽洗涤不彻底 样液中可能含有含氮非蛋白成分 收集氨气过程中带入了水蒸气，对硼酸的pH产生了一定的影响 滴定时终点的判断存在一定的人为误差。 3、与Folin-酚法测定的结果相比，结果偏大，可能的原因是样液中含有含氮非蛋白物质，或者洗涤时不够彻底

43、，反应室内还有残留。 4、实验选取的是热提取液B，作为实验的样液，未选择C、D，其原因是样品C、D中均有Tris-HCL溶液，而Tris-HCL溶液是含有氮元素的，这会对实验造成影响。2.5.5 结论 本实验以热提取液B0.1ml为样液，采用微量凯氏定氮法进行含氮量测定，测得样品总氮量为17.21mg/ml，样品总蛋白质含量为107.56mg/ml。该方法测得的蛋白质含量比用Folin-酚法测得的高，这是由实验中存在的误差造成的，微量凯氏定氮法比Folin-酚法操作复杂，但干扰小，精确度大。2.6 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量2.6.1实验原理 电泳是指溶液中带点粒子在外加电场的作

44、用下，向相反电极方向移动的现象。蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶孔径大小可通过改变Acr和Bis浓度来调节。浓度越大，孔径越小，颗粒穿过网孔的阻力越大，反之亦然。网孔大小根据所分离物的分子量的大小来选择。本实验选择分离胶浓度12%。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续的凝胶电泳两类。不连续凝胶电泳有三大效应： （1）浓缩效应：两

45、层凝胶的孔径不同（孔径的不连续性）；                 缓冲液与凝胶离子成分和pH不同（缓冲系统的不连续性） （2）分子筛效应：颗粒小，圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大，形状不规则的分子阻力较大，移动较慢。 （3）电荷效应：大部分蛋白质在pH8.3带负电，电荷多迁移快 SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂。它可以破坏蛋白质分子之间的非共价键，形成带大量负电荷的蛋白质-SDS复合物，

46、使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷的差异；引起蛋白质分子构象的改变。2.6.2材料与方法2.6.2.1材料2.6.2.1.1试剂 30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4保存一个月。两种单体和溶液都是中枢神经毒物，要戴手套小心操作，不可直接接触。 10%的TEMED；  10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；  分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tr

47、is 9.08g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定容至50mL，4保存；  浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定容至50mL，4保存；  2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4保存

48、。 SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，加入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5×SDS-电极缓冲液。  10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。     染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL    

49、0; 冰醋酸，用滤纸过滤。 脱色液：50ml甲醇加75ml冰醋酸，加蒸馏水至1000ml。2.6.2.1.2 器材 SDS-聚丙烯酰胺不连续垂直板型凝胶电泳 玻璃板;  大培养皿； 烧杯；吸量管；滴管。2.6.2.2 实验方法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法2.6.3 操作过程 1、分离胶制备          装配制胶工具，按表比例配制分离胶，小心加满水，待聚合好后，倾去水，用滤纸片吸干胶面。     2、浓缩胶制备  

50、60;       按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。          3、加样          取100L样品与100L样品缓冲液混合，沸水浴3-5min，取20L各样品加入齿孔中，将电极缓冲液倒入电泳槽。  4、电泳     &#