研究生基本实验技能培训 ppt课件

1、研讨生科研实验教学基地建立研讨生科研实验教学基地建立根本实验技艺培训根本实验技艺培训首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院根底医学研讨中心根底医学研讨中心 梁燕梁燕85231624, liangyan1990shou主要内容1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷须知2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作本卷须知3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作本卷须知1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷须知既要将既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分别，与蛋白质、脂类和糖类等分别，又要坚持又要坚持DNA分子的完好。分子的完好。 仪器预备：仪器

2、预备： 台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液器、离心管灭菌、吸头度计、移液器、离心管灭菌、吸头灭菌、镊子灭菌、离心管架灭菌、镊子灭菌、离心管架试剂预备：试剂预备： 试剂盒、无水乙醇等试剂盒、无水乙醇等试剂盒内容试剂盒内容操作步骤重点操作步骤重点向52ml的缓冲液GD中参与68ml无水乙醇，并标志；向50ml的缓冲液PW中参与200ml无水乙醇，并标志；取200ul全血，参与20ul的蛋白酶K溶液，混匀；参与200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。参与200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时能够会出现絮状沉淀。

3、将吸附柱CB3放入搜集管中预备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱放回搜集管；假设步骤5的溶液不能一次加完，可以再次反复步骤6；向吸附柱中加500ul的缓冲液GD， 12000rpm离心30秒，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱放回搜集管；操作步骤重点操作步骤重点7. 向吸附柱中参与700ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱放回搜集管；向吸附柱中参与500ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱放回搜集管；将吸附柱和搜集管再次离心， 12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室

4、温放置数分钟；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟， 12000rpm离心2分钟，将溶液搜集到离心管中；测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。计算公式：OD260/OD280=1.7-1.9DNA浓度(ug/ul)=OD26050稀释倍数/1000OD260=0.1稀释倍数=250DNA浓度=0.150 250/1000=1.25 ug/ul操作本卷须知操作本卷须知防止样品反复冻融防止样品反复冻融56水浴摇匀可消除水浴摇匀可消除GB中的沉淀中的沉淀运用台式离心机，室温离心运用台式离心机，室温离心2.PCRPC

5、R体系和循环条件PCR操作步骤操作本卷须知仪器预备：仪器预备： PCRPCR仪，微型离心机、移液器、离心管仪，微型离心机、移液器、离心管灭菌、吸头灭菌、镊子灭灭菌、吸头灭菌、镊子灭菌、离心管架菌、离心管架试剂预备：试剂预备： ddH2O, PCR BufferddH2O, PCR Buffer，dNTPdNTP，引物，引物，PCRPCR聚合酶，聚合酶，DNADNA模板模板BclI PCRTotal volume25ul*2ddH2O16.5ul33ul10Buffer 2.5ul5uldNTP (25mM)2ul4ulPrimer F (10mM)1ul2ulPrimer R (10mM)1u

6、l2ulEx Taq (1U/ul)1ul2ulSum24ul48ul48/2=24ulTemplate DNA（0.1ug/ul)1ul1ul60 ，30s72 ，30s95，30s95，30s 预变性预变性72 ，30s 后延伸后延伸30cycles 计算好所需扩增的计算好所需扩增的PCR体系；体系； 翻开翻开PCR仪预热，设置仪预热，设置PCR循环条件；循环条件； 预备试剂，融化，离心，置于冰上，备用；预备试剂，融化，离心，置于冰上，备用； 按顺序加样，混匀，离心，分装；按顺序加样，混匀，离心，分装； 参与模板参与模板DNA，混匀，离心；，混匀，离心； 放入放入PCR仪，仪，Start。

7、防止试剂反复冻融防止试剂反复冻融计算总量，顺序加样计算总量，顺序加样改换吸头，防止污染改换吸头，防止污染3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作本卷须知DNADNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；其挪动速度与线性其挪动速度与线性DNADNA片段长度成反比。片段长度成反比。 配置配置1%1%的胶：称的胶：称1g1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml100ml的的1 1* *TAETAE，微波炉加热至完全融化；，微波炉加热至完全融化； 待凝胶温度降至待凝胶温度降至50-6050-60度时，参与度时，参与1

8、ul1ul的的EBEB10mg/ml)10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-6030-60分钟；分钟； 悄然拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入悄然拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1 1* *TAETAE，没过，没过加样孔；加样孔； 按照按照1ul1ul上样上样Buffer+5ulBuffer+5ul的的DNADNA混合后，点样；每排留混合后，点样；每排留一个孔加一个孔加DNA markerDNA marker； 100V100V电泳电泳3030分钟，凝胶成像仪照相。分钟，凝胶成像仪照相。带手套操作带手套操作EB凝胶冷却时间至少凝胶冷却时间至少30分钟分钟凝胶完全融化凝胶完全融化M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0运用运用BclI/RFLP BclI/RFLP 多态位点进展基因连锁分析多态位点进展基因连锁分析374211163小小 结结1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷须知2.PCRPC