CH5-2固定化酶的性质ppt课件

1、CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质1. 固定化处置对酶性质的影响固定化处置对酶性质的影响 从溶液酶的游离形状，到固定化酶的“局限形状，是一个很大的转变。不仅酶分子本身，而且酶反响的环境也有所不同。因此，固定化酶的性质与溶液酶大相径庭固定化酶的制备方法很多，酶在固定化过程中，对酶反响系统产生的影响各不一样。我们假定酶固定化之后，在载体外表或多孔介质内的分布完全均匀，我们不思索固定化处置过程中，技术操作的问题，我们可以将固定化带来影响概括为如下三个方面： 构象改动、立体屏蔽构象改动、立体屏蔽酶在固定化过程中，由于酶和载体之间相互作用，引起酶分子构象发酶在固定化过程中，由于酶和载体之间相互作用

2、，引起酶分子构象发生某种扭曲，从而导致酶与底物的结合才干或催化底物转化才干发生生某种扭曲，从而导致酶与底物的结合才干或催化底物转化才干发生改动，在大多数情况下，固定化致使酶活性不同程度下降。而立体屏改动，在大多数情况下，固定化致使酶活性不同程度下降。而立体屏蔽是指固定化后，由于载体孔隙太小，或固定化的结合方式不对蔽是指固定化后，由于载体孔隙太小，或固定化的结合方式不对( (如下如下图图) )使酶活性中心或调理部位呵斥某种空间妨碍，使效应物或底物与酶使酶活性中心或调理部位呵斥某种空间妨碍，使效应物或底物与酶的临近或接触遭到限制。的临近或接触遭到限制。图图 固定化酶的立体屏障效应固定化酶的立体屏障

3、效应活性中心向里活性中心向里活 性 中 心 向活 性 中 心 向外外 分配效应和分散限制分配效应和分散限制这两种效应都和微环境亲密相关。所谓微环境是指紧邻固这两种效应都和微环境亲密相关。所谓微环境是指紧邻固定化酶的环境区域，主要是载体的疏水亲水及电荷性质带定化酶的环境区域，主要是载体的疏水亲水及电荷性质带来的影响。来的影响。 分配效应分配效应 是由于载体性质呵斥的酶的底物或其他效是由于载体性质呵斥的酶的底物或其他效应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配，从而影响应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反响速度的一种效应。酶促反响速度的一种效应。 分散限制效应分散限制效应 是指底

4、物、产物和其它效应物在环境是指底物、产物和其它效应物在环境中的迁移运转速度遭到的限制造用。有外分散限制和内分中的迁移运转速度遭到的限制造用。有外分散限制和内分散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层( (又称又称NernslNernsl层层) )到达颗到达颗粒外表时所遭到的限制。内分散限制是指上述物质进一步粒外表时所遭到的限制。内分散限制是指上述物质进一步向颗粒内部酶所在点分散所遭到的限制。向颗粒内部酶所在点分散所遭到的限制。 微扰微扰由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数

5、等性质，直由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质，直接影响酶的催化才干或酶对效应物作出反响的才干，这种接影响酶的催化才干或酶对效应物作出反响的才干，这种效应称为微扰。目前还不能作定量描画。实践上构象改动，效应称为微扰。目前还不能作定量描画。实践上构象改动，立体屏蔽效应，也还不能作定量描画。近年来，关于蛋白立体屏蔽效应，也还不能作定量描画。近年来，关于蛋白质质“可及外表计算方法的进展，似为这几种效应的定量讨可及外表计算方法的进展，似为这几种效应的定量讨论，展现了一种前景。以上效应将详细表如今酶的动力学论，展现了一种前景。以上效应将详细表如今酶的动力学性质、酶的稳定性、酶促反响影响要素、乃

6、至酶的底物专性质、酶的稳定性、酶促反响影响要素、乃至酶的底物专注性等方面。注性等方面。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质2. 固定化的酶性质固定化的酶性质 分配效应对分配效应对KmKm的影响的影响 这种影响通常用分配系数这种影响通常用分配系数()()来描画：来描画：SiSiS (1)S (1)式中式中SiSi和和SS分别表示底物或其它效应物分别表示底物或其它效应物在微环境中的部分浓度和宏观体系中的在微环境中的部分浓度和宏观体系中的总体总体( (或平均或平均) )浓度。浓度。对最简单的固定化酶系统而言，其动力学性态，普通仍对最简单的固定化酶系统而言，其动力学性态，普通仍服从米氏方程。当反响

7、系统进展充分搅拌，消除外分散服从米氏方程。当反响系统进展充分搅拌，消除外分散限制影响时，只思索分配效应的影响，那么反响速度可限制影响时，只思索分配效应的影响，那么反响速度可表示如下：表示如下： VmaxSi VmaxSi v= (2) v= (2) Km+Si Km+Si VmaxS VmaxS = (3) = (3) Km+S Km+S VmaxS VmaxS VmaxS VmaxS = = (4) = = (4) Km/+S K Km/+S Km+Sm+S K Km= Km/ (5)m= Km/ (5)这阐明分配系数的影响，是改动了这阐明分配系数的影响，是改动了KmKm。K Km m是分配

8、效应是分配效应影响下的表观米氏常数。由式影响下的表观米氏常数。由式(1)(1)和和(5)(5)，可以看出，可以看出SiSiSS，那么，那么1 1， K Km mKmKm，阐明固定化作用降低酶，阐明固定化作用降低酶对底物的亲和力。对底物的亲和力。 经过载体和底物电荷性质、离子强度和经过载体和底物电荷性质、离子强度和pHpH值对分配值对分配效应的影响讨论，可以得出普通性规律如下：效应的影响讨论，可以得出普通性规律如下： 载体与底物带一样电荷时，相斥，载体与底物带一样电荷时，相斥，SiSiSS，K Km mKmKm。 当载体带正电荷时，部分当载体带正电荷时，部分H+ H+ 浓度低于总体浓度，浓度低于

9、总体浓度，SiSi变大，变大，K K变小，即酶活力一变小，即酶活力一pHpH曲线向酸性方向偏移，曲线向酸性方向偏移，亦即最适亦即最适pHpH向酸性方向偏移；反之，离子载体将向碱性向酸性方向偏移；反之，离子载体将向碱性方向偏移，如下图。方向偏移，如下图。1. 1. 载体带正电荷，载体带正电荷， 最适最适pHpH向偏酸性偏移；向偏酸性偏移；2. 2. 游离酶的最适游离酶的最适pHpH3.3.载体带负电荷，载体带负电荷， 最适最适pHpH向偏碱方向偏移；向偏碱方向偏移； V 上述效应，经过提高反响系统的离子强度，可以减弱或消除。当离子强度等于载体电荷基团浓度一半时，KmKm2，当离子强度远大于载体电

10、荷基团浓度时，KmKm。 采用疏水性载体时，如底物为极性物质或电荷性物质，那么Si小，KmKm；如底物为疏水性物 CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质2. 固定化的酶性质固定化的酶性质 分散限制效应分散限制效应 酶固定化之后，由于分散限制，使得酶往往不能得酶固定化之后，由于分散限制，使得酶往往不能得到宏观体系一样程度的底物，因此观测到的实效反响到宏观体系一样程度的底物，因此观测到的实效反响速度，常低于实际预测的程度。对于这种影响，通常速度，常低于实际预测的程度。对于这种影响，通常援用实效系数援用实效系数OO进展定量讨论。进展定量讨论。 v=Ovp O = v /vp v=Ovp O = v

11、 /vp 1 1式中式中v v为实效反响速度，为实效反响速度，vpvp为实际预期反响速度，即由溶为实际预期反响速度，即由溶液酶的米液酶的米孟氏方程确定的速度。孟氏方程确定的速度。 VmaxS VmaxS VmaxS VmaxS 由由 v= v= O O 2 2 Km+S Km+S Km+S Km+S 如前所述，分散包括外分散和内分散两方面。 外分散实践上包括分子分散和对流分散两部分。在固定化酶反响操作中，可以经过搅拌混和而消除或减弱其限制造用。动力学分析指出，外分散限制效应影响下，酶反响实效速度普通低于酶促转化动力学规定的速度。因此，这种分散限制可以看作是一种抑制效应，可称为分散抑制。 内分散

12、限制对酶反响动力学的影响，在某种程度上比外分散限制更突出，更重要。动力学实际分析所得出的一些主要结论有以下三点，可以用定性的言语来描画。 底物和其它效应物分子量对分散速率的影响分析阐明，普通情况下，固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的实效反响速度下降程度比溶液酶更大。许多实验结果与此实际分析是一致的。 载体构造的影响分析阐明，内分散限制取决于载体的孔隙率、孔隙半径、孔隙曲折程度。即：底物的内分散系数与载体孔隙率成正比，与底物在宏观体系中固有的分散系数成正比，与载体孔隙的曲折系数成反比，与载体膜厚度或载体颗粒半径的平方成反比。实验支持了这一实际分析。 内分散限制与酶反响固有速度有关。即是说

13、固有反响速度vp 大，酶反响的底物转移系数也大，当S小于0.1 Km时，O大，那么固定化酶反响速度也相对大。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 酶活力回收率酶活力回收率 游离酶经过固定化以后，酶活力往往下降。固定游离酶经过固定化以后，酶活力往往下降。固定化酶所保管下来的酶活力与游离酶在固定化之前的酶化酶所保管下来的酶活力与游离酶在固定化之前的酶活力之比，称为该酶活力回收率，也叫固定化效率、活力之比，称为该酶活力回收率，也叫固定化效率、残存活力等。在不思索分散限制影响的情况下，固定残存活力等。在不思索分散限制影响的情况下，固定化酶的酶活力回收率可以

14、经过实验测得化酶的酶活力回收率可以经过实验测得由下式求得：由下式求得： V Vm .Bimm .Bim Fim Fim 100% 100% Vm .B Vm .B式中式中FimFim为活力回收率为活力回收率( () )，B B为固定化前所用的游离为固定化前所用的游离酶溶液体积；酶溶液体积；BimBim为制得的固定化酶湿体积；为制得的固定化酶湿体积；Vm Vm 为固为固定化前的酶的最大反响速度；定化前的酶的最大反响速度；V Vm m 固定化酶测得的表固定化酶测得的表观最大反响速度。观最大反响速度。关于固定化酶收率问题，有不同得报道，上述方法思索了在固定化处关于固定化酶收率问题，有不同得报道，上述

15、方法思索了在固定化处置过程中，有未被固定化的酶蛋白、在固定化过程中失活的酶蛋白以置过程中，有未被固定化的酶蛋白、在固定化过程中失活的酶蛋白以及在固定化后及在固定化后KcatKcat的变化降低或升高；的变化降低或升高；而另一种方法是：而另一种方法是： V Vm .Bimm .Bim Fim Fim 100% 100% Vm . Vm .B BB B式中符号与上式一样，式中符号与上式一样，B B为固定化处置后，回收的未固定的酶蛋白的为固定化处置后，回收的未固定的酶蛋白的量。实践上这种方法，只思索了在固定化处置过程中，固定化方法对量。实践上这种方法，只思索了在固定化处置过程中，固定化方法对酶蛋白构型

16、、活性中心等的影响，把未被固定化的酶蛋白作为回收思酶蛋白构型、活性中心等的影响，把未被固定化的酶蛋白作为回收思索。索。 固定化酶的话力回收率因所采用的固定化方法而异。普通来说，Fim 值按以下固定化方法顺序递减： 吸附法凝胶包埋法微型胶囊包埋法交联法 例如，李增吉等(1993年)报道，用DEAE纤维素直接吸附天冬氨酸酶，酶活力回收达90；以聚乙烯基吡啶与聚甲基丙烯酸复合物包埋同一酶，当加酶量为每1克复合物8.40mg和16.8mg时，酶活力回收分别可达87和94。姜涌明等(1993年)用壳聚糖作载体，戊二醛作交联剂，分别对木瓜蛋白酶、AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶进展固定化，在最

17、正确条件下，固定化酶的活力回收率分别为47、74、50和55。 底物专注性变化底物专注性变化 对于作用于大分子底物的酶，当其固定于水不溶性载体之对于作用于大分子底物的酶，当其固定于水不溶性载体之后，往往由于空间妨碍，而使酶对分子量大的底物的催化后，往往由于空间妨碍，而使酶对分子量大的底物的催化活性大大下降。例如，糖化酶用活性大大下降。例如，糖化酶用CM一纤维素经化学法共一纤维素经化学法共价固定化后，对分子量为价固定化后，对分子量为8000的直链淀粉的催化活性下降的直链淀粉的催化活性下降23，而对分子量为，而对分子量为500000的直链淀粉的催化活性下降的直链淀粉的催化活性下降85一一87。 反

18、响的最适反响的最适pH值变化值变化许多实验证明，酶固定化后的反响最适许多实验证明，酶固定化后的反响最适pH值会发生不同程值会发生不同程度的变化。例如，天冬氨酸酶固定于疏水载体度的变化。例如，天冬氨酸酶固定于疏水载体N烷基琼烷基琼脂糖珠之后，酶的最适反响脂糖珠之后，酶的最适反响pH与液酶相比，向碱性区挪动与液酶相比，向碱性区挪动了了04个个pH单位，为单位，为pH89马林等，马林等，1991)。 胰蛋白酶胰蛋白酶用戊二醛固定于脱乙酰壳聚糖载体后，最适用戊二醛固定于脱乙酰壳聚糖载体后，最适pH范围加宽，范围加宽，由液相酶的由液相酶的pH8.0变为变为pH7.09.0(隋德新等，隋德新等，1991)

19、。另外。另外也有实验证明固定化酶最适也有实验证明固定化酶最适pH移向酸侧的。移向酸侧的。 反响最适温度的变化固定化酶的最适反响温度，在很多情况下是高于游离酶的。同上实验的固定化天冬氨酸酶最适反响温度提高了5，为50；胰蛋白酶也提高了5，为60，而且即使在70仍有较高的活性。用CM纤维素叠氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度那么比游离酶高515。也有固定化酶的最适温度不变的，例如壳聚糖固定化胃蛋白酶。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 米氏常数变化 酶被固定化后，米氏常数的变化前已推导，下表所列固定化酶的Km值与游离酶的Km值之比值：酶载

20、体固定化方法底 物Km/ Km无花果酶肌酸激酶天冬酰胺酶木瓜蛋白酶 CM-纤维素CM-纤维素尼龙火棉胶 肽键结合法 肽键结合法微囊吸附 苯甲酰精氨酸乙酯ATP、肌酸Asn苯甲酰精氨 0.9 101021.8 普通来说，酶在固定化以后，普通都表现为普通来说，酶在固定化以后，普通都表现为KmKm值增大，值增大，即即K Km/Kmm/Km大于大于l l。 CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质3. 固定化的酶催化条件固定化的酶催化条件 最大反响速度的变化固定化酶的最大反响速度(Vm)与游离酶的Vm值大多根本一样，现实上，对于最大反响速度的比较是很难进展的，由于Vm与反响体系中的加酶量有关，单纯Vm

21、的比较，也难以阐明什么问题，最客观的比较参数应该是Kcat但到目前笔者尚未收到有关研讨资料报道。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质4. 固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性 固定化酶的热稳定性大多数酶经固定化以后，热稳定性提高。例如，乳酸脱氢酶、脲酶、氨基酰化酶、胰蛋白酶等，固定化后，热稳定性都比游离酶高；也有固定化之后耐热性反而下降的例子。DEAE纤维素离子交换吸附的转化酶，40加热30分钟，其剩余活力为4，而游离酶，在一样条件下其活力为100。 固定化酶对化学试剂的稳定性大多数情况下，酶固定化之后，加强了对化学试剂的耐受力。例如氨基酰化酶，用DEAE葡聚糖交换吸附法制成固定化酶后，在6m

22、olLl尿素、2molLl中，保管活力分别为146和117；而游离酶在相应条件下，保管活力仅9和49。CMC偶联的胰蛋白酶，在3molLl 脲中的保管活力为120，游离酶只60。尿素、盐酸脲这样的蛋白量变性剂，不仅没有损失固定化酶的活性，反而提高酶活性的景象，据以为能够与酶的柔顺性添加有关。个别酶如葡萄糖淀粉酶，固定化以后，对某些抑制剂更为敏感。 固定化酶对蛋白酶的稳定性普通来说，酶固定化以后，加强了对蛋白酶的抵抗力。例如用尼龙或聚服膜包埋，或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而游离酶在同样条件下，几乎全部失活。据以为，这能够与固定化酶的载体不允许大分子酶蛋白透过有关。 固定化酶

23、的操作稳定性和贮藏稳定性大多数酶固定化以后，操作稳定性和贮藏稳定性都明显提高。这对工业消费是很重要的有利性质。例如三酯酸纤维素包埋的转化酶，在25操作530日，活力仅丧失一半。重氮化结合于多孔玻璃的葡萄糖异构酶，60下的半寿期为14天。普通说来，操作稳定性要有一个月以上的半寿期，才有工业运用价值。 贮藏稳定性下降的例子也存在。游离核酸酶4下保管一周，活力不减；而共价固定化酶(载体苯乙烯马来酐)那么丧失50的活力。CH5-2 固定化酶的性质固定化酶的性质5. 固定化酶稳定性的途径固定化酶稳定性的途径讨论固定化过程加强酶稳定性的机制，从中寻求提高讨论固定化过程加强酶稳定性的机制，从中寻求提高固定化

24、酶稳定性途径，是值得注重的课题，不少研讨固定化酶稳定性途径，是值得注重的课题，不少研讨者已在这方面作了有益探求。初步归纳有以下几点。者已在这方面作了有益探求。初步归纳有以下几点。 用化学修饰添加与载体相反的电荷 例如用乙酰酐和琥珀酰酐作为酶的酰化剂，酶经酰化后与阴离子交换剂DEAE纤维素结合。如此制备的固定化葡萄糖淀粉酶，55糖化可溶性淀粉，经7.5小时，酶活力保管71，而未经酰化的固定化酶，只保管17的活力。 固定化酶与底物构成复合物固定化酶与底物构成复合物 研讨固定化多核苷酸研讨固定化多核苷酸磷酸化酶微环境对酶稳定性的作用时，证明固定化酶磷酸化酶微环境对酶稳定性的作用时，证明固定化酶与其反

25、响产物大分子核酸构成的复合物，对酶的稳定与其反响产物大分子核酸构成的复合物，对酶的稳定性起很大的作用。性起很大的作用。 在实践任务中，经常在固定化处置时，先将在实践任务中，经常在固定化处置时，先将酶和底物结合，以酶底物复合物的方式进展，获得酶和底物结合，以酶底物复合物的方式进展，获得的固定化酶的收率和稳定性都有明显改善。的固定化酶的收率和稳定性都有明显改善。 添加隋性蛋白质添加隋性蛋白质 研讨固定化葡萄糖氧化酶的稳定研讨固定化葡萄糖氧化酶的稳定性指出，在固定化过程中，以性指出，在固定化过程中，以1 1：10(10(酶：酶：Hb)Hb)的比例添的比例添加血红蛋白，提高酶活性效果最为明显，这能够是

26、惰加血红蛋白，提高酶活性效果最为明显，这能够是惰性蛋白质提供了对酶更为有利的微环境之故。性蛋白质提供了对酶更为有利的微环境之故。 加强载体凝胶多孔性和构造有序性加强载体凝胶多孔性和构造有序性 研讨卡拉胶的研讨卡拉胶的构造与其包埋的异构酶热稳定性的关系时，发现含硫构造与其包埋的异构酶热稳定性的关系时，发现含硫酸根多的卡拉胶，具有较好的孔隙性和构造上的有序酸根多的卡拉胶，具有较好的孔隙性和构造上的有序性。而这种有序性与酶对底物的亲和力呈正相关。在性。而这种有序性与酶对底物的亲和力呈正相关。在制备固定化酶时，添加氨基葡萄糖，可提高胶的构造制备固定化酶时，添加氨基葡萄糖，可提高胶的构造有序性，同时得到

27、了理想的酶稳定性。有序性，同时得到了理想的酶稳定性。 同时固定化能消除产物抑制的酶 葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的产物之一为H202，易使该酶钝化，假设同时固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化氢酶(Cat)，当CatGOD为27时，固定化双酶，使葡萄糖氧化酶半寿期延伸了12倍。25延续运用36小时活力不变，半寿期达1155小时(约：，48天)。 CH5-3固定化酶反响器固定化酶反响器1.固定化酶反响器类型固定化酶反响器类型 酶反响器是以酶作为催化剂进展反响所需的设备。性能优良的反响器，可大大提高消费效率。酶反响器的方式很多，根据进料和出料方式，可概括为两种类型：分批搅拌式反响器(BR)与延续流式反响

28、器(CFR)。后者又有两种根本方式：延续流搅拌桶(罐)反响器(CST)、复合搅拌反响器CSR、填充床反响器(PR) 和流化床反响器FBR。CH5-3固定化酶反响器固定化酶反响器 1.固定化酶反响器类型固定化酶反响器类型 CH5-3固定化酶反响器固定化酶反响器 1.固定化酶反响器类型固定化酶反响器类型 分批搅拌反响器 这类反响器构造简单，不需特殊安装，适于小规模实验。目前我国酶反响器主要用这种方式的反响器。用溶液酶或粗酶制剂催化时，酶普通不回收，待反响转化为一定程度后，直接加热或用其它方法使酶失效除去。这种反响器在工业消费中，很少采用固定化酶，由于在反复过滤或离心回收过程中，容易呵斥酶失效损失。 填充床反响器 这是当前采用最多的一种反响器方式。床内通常用颗粒状或片状固定化酶填充，也可平行地填充各向异性的半透性中空纤维；或者作成管状，内部填充酶膜、酶片等。运转时，底物按照一定方向以恒定流速经过反响床。根据底物流动方式，又有下向流动，上向流动和循环法之分。工业消费中，液流方向常用上向方式，防止下向流动的液压对柱床的影响。对反响产生气体者尤应留意。 流化床反响器 和延续流搅拌桶反响器一样，是让适量的颗粒状酶悬浮于反响