试验十一化妆品细菌总数及绿脓假单胞菌检测

1、化妆品细菌总数检测【目的】掌握化妆品采样方法、样品处理过程、细菌总数的测定和实验结果的判定。【卫生学意义】化妆品是清洁、护肤、美化人民生活不可缺少的必需品，然而，化妆品在生成、储藏和使用过程中难免受到污染，同时化妆品中人工合成原料成分较多， 剂 型各异，不少剂型富含水分和营养成分，如蛋白质、氨基酸、维生素、无机盐等， 为微生物生长繁殖提供了条件。细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。化妆品中污染菌种类不 同，每种细菌都有一定的生理特性，对营养要求、培养温度、培养时间、pH值,需氧性质等均有不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测 定的结果，只包括在本方法所使用的条件下

2、（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37c培养48h）生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的菌落总数。本标准采用 平板计数法。【试验材料】1.样品：爽肤水，洗面奶（水溶性的）2.3.4.5.生理盐水：90ml/瓶,1瓶/组；9ml/支，2支/组 卵磷脂-吐温80营养琼脂：1瓶/组 一 1ml移液器、一次性平皿:5ml吸管：1支/组 7个/组卵磷脂和吐温80能中和防腐剂，并能起 到在乳浊液中分散物质的功能【样品的处理】亲水性膏、霜液体样品：10g （10ml） +90ml生理盐水一 1： 10稀释液【菌落总数的测定】1 .样品的稀释：1ml+9ml生理盐水一 1: 100稀释液1ml+9ml生理盐水一

3、 1: 1000稀释液2 .取2ml,分别注入到2个灭菌平皿中，每皿1ml 3 .取2ml,分别注入到2个灭菌平皿中，每皿1ml 6 6个平皿4 .取2ml,分别注入到2个灭菌平皿中，每皿1ml J5 .空白对照：1ml无菌生理盐水6 .将冷却至45-50C的卵磷脂-吐温-80营养琼脂倾注平皿内，15ml/皿，随即 轻轻转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，反转平皿，置 37 c 培养 48h07 .菌落计数及报告方式。【结果评价】参照国家卫生标准进行卫生评价 :246页化妆品中铜绿假单胞菌的检测【试验目的】掌握化妆品中铜绿假单胞菌的检验程序和检验方法，掌握其阳性判断标准。【卫生意义

4、】铜绿假单胞菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致 病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常 使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品中规定不得检出铜绿假单胞菌。根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓毒素。此外，还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42c条件下生长等，可与类似菌相区别。【试验材料】铜绿假单胞菌（绿脓）：1皿/组（斜面）玻片：讲台上氧化酶试纸：用时发放，1条/2组绿脓毒素测定用培养基（L） : 1支/组硝酸盐蛋白陈水培养基：1支/组明胶培养基：1支/组琼脂斜面培养基（Y）: 1支/组氯仿，1mol/L盐酸（明天

5、看结果用）【检验程序】检样前处理I堆菌培养（SCDLP液体培笄甚）I分寓培养（十六烷三甲黄或化馁培养基）Ir1除片染色辐检氧化罩试翻联脓效素试验I;明胶液化试疆 硝酸批还原产气试验生长试验结累报告【实验方法】样品处理：亲水性膏、霜液体样品：10g （10ml） +90ml生理盐水一 1： 10稀释液。二、增菌培养：取1: 10样品稀释液10ml + 90ml SCDLP液体培养基中，37c培 养 18-24h。+ :黄绿色或蓝绿色薄菌膜SCDLP液体培养基：（卵磷脂、吐温 80大豆消化酪蛋白液体培养基）用途：用于疏水性化妆品样品处理及化妆品和一次性使用卫生用品增菌培养（化妆品卫生规范微生物检验

6、方法2007版和GB15979-2002）。原理：酪蛋白豚和大豆蛋白陈 提供氮源、维生素和生长因子； 氯化钠维持均衡的 渗透压；磷酸氢二钾为缓冲剂；葡萄糖为可发酵的糖类；卵磷脂和吐温80能中和 防腐剂，并能起到在乳浊液中分散物质的功能，卵磷脂能中和季俊盐，吐温 80可 中和酚、六氯酚、福尔马林，两者结合可中和乙醇二、分离培养：培养液的菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基澳化俊琼脂平板上， 置37c培养1824h,凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周 边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基扩散有水溶性色 素。在缺乏十六烷三甲基澳化俊琼脂时也可用乙酰胺培养基进行

7、分离，将菌液划线接种于平皿中，37c培养24h,铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁 平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。十六烷三甲基澳化俊琼脂用途：用于绿脓杆菌及其它革兰氏阴性非发酵菌的选择性分离培养（GB15979-2002 ,化妆品卫生规范微生物检验方法 2007版）。原理：蛋白陈和牛肉膏粉 提供碳氮源、维生素和生长因子； 氯化钠维持均衡的渗 透压；十六烷三甲基澳化钱 为选择性抑菌剂，作为一种季俊盐阳离子去污剂可释 放细菌细胞中的氮和磷而抑制非绿脓杆菌的细菌；琼脂是培养基的凝固剂。乙酰胺培养基用途：用于革兰氏阴性非发酵菌特别是绿脓杆菌的选择性分离培养（化妆品卫生规范

8、微生物检验方法2007版）。原理：具有乙酰胺酶的细菌能利用 乙酰胺作为碳源，并分解乙酰胺产碱；氯化钠 维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾 为缓冲剂；硫酸镁提供生长必要的 离子；琼脂是培养基的凝固剂；酚红为pH指示剂四、证实试验1 .染色镜检：革兰氏阴性杆菌2 .氧化酶试验：用取菌环取待检菌涂于氧化酶试纸或直接用纸片沾取菌落，然后将纸片置于干净平皿内，30秒钟内观察结果，阳性为紫色，阴性为无色。3 .绿脓毒素试验：取可疑菌落 23个，分别接种在绿脓毒素测定用培养基上 (L),置37c培养24h,加入氯仿3ml5ml,充分振荡，用吸管将氯仿移到另一试管中，并加入1mol/L盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸 液内出现粉红色时为阳性，表示被捡物中有绿脓毒素存在。4 .硝酸盐还原产气试验：取铜绿假单胞菌可疑菌落接种在硝酸盐蛋白陈水培养 基中，置37c培养24h,观察结果，凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气 体者，即为阳性，标明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。5 .明胶液化试验：取铜绿假单胞菌可疑菌落接种在明胶培养基中，置 37c培养 24h,取出放4c冰箱10min30min,如仍呈溶解状即为明胶液化试验阳性， 如凝固不溶者为阴性。6 . 42c生长试