试验三培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定

1、实验三培养基的制备灭菌及生活饮用水中细菌总数测定一、实验目的和要求掌握微生物培养基和无菌水的制备方法；学习实验器材及培养基等灭菌方法。验证性实验，实验时数可安排为2学时。二、实验设备与仪器1 .培养皿15-20套，i管6支-10支，移液管10 mL 1支，1 mL 2-4支，锥形瓶2个， 烧杯300 mL 1个，玻璃珠。120 mL三角瓶1个。2 .纱布、棉花、牛皮纸、报纸、细铁丝、厌氧袋。3 . pH 试纸 6-8 （或 pH 仪）、10% HCl、10% NaOH。4 .牛肉膏、蛋白月东、氯化钠、琼脂、蒸储水。5 .高压蒸汽灭菌装置、烘箱、电炉、冰箱、净化工作台。三、实验前准备工作1 .预

2、习实验指导书实验三的内容。2 .复习课堂教学有关微生物营养和培养基制备原则，微生物的灭菌原理等内容。四、实验注意事项1 .实验过程中使用高压灭菌装置应严格按照操作规程进行，才能达到灭菌效果。使用 时应注意安全操作。五、实验原理灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和其芽抱（或抱子）。消毒是用物理、化学因素杀死病原微生物和部分微生物。灭菌方法有高温灭菌、紫外线灭菌、超声波灭菌、灼烧灭菌等，消毒方法有化学试剂消毒、过滤消毒等。高温灭菌是主要灭菌方法。高温灭菌常有两种方法，干热灭菌和高压蒸汽灭菌。高压蒸 汽灭菌时湿热的穿透力和热传导强，湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白容易凝固变性。高压蒸汽

3、灭菌的温度是 121,灭菌15-30分钟；干热灭菌温度是 160 ,灭菌2小时。六、实验内容1 .玻璃器皿的洗涤和包装，灭菌前的准备工作；2 .为下个实验制备所需的培养基和无菌水;3 .学习高压蒸汽灭菌技术；七、实验方法与步骤1 .玻璃器皿的洗涤与包装(1)洗涤：培养皿、试管、三角瓶用毛刷蘸洗涤剂洗刷-用自来水冲洗干净，不挂水珠为止-105c烘箱烘干，待用。移液管先用洗液浸泡 -用镣子取出-自来水冲洗干净-烘箱烘干备用。(2)包装：1)培养皿15-20套，用牛皮包装 -棉线包扎-待灭菌；2)移液管包装：移液管10 mL 1支，1 mL 2支一 移液管的吸入端用铁丝塞入少 许棉花约1-1.5 c

4、m长棉签用4-5 cm宽的长纸条从一方向包裹移液管至另一端多余纸打结，以达密封效果；3)试管、三角瓶的包装：取试管5-10支，在试管和瓶口加棉塞 -棉塞插入瓶口中2/3, 试管用报纸包装-棉线包扎-待灭菌。2 .培养基制备(1)配制溶液：按实验中培养微生物种类选取培养基配方。例，营养琼脂培养基的配制：在天平上称量：蛋白月东1克，牛肉膏0.3克，氯化钠0.5克-放入300 ml烧杯中 -加100 ml蒸储水- 在电炉上加热，用玻棒不断搅拌溶解 - 加入1-2克琼脂f 加热不断 搅拌至溶解。(2)用蒸储水补充因蒸发损失的水分。(3)用 10% NaOH 或 10% HCl 调培养基 pH=7.4-

5、7.6 ;(4)过滤：乘热用纱布或药棉在漏斗中过滤培养基分装在三角瓶中加塞 待灭菌。要求：配制细菌培养基、真菌培养基、放线菌培养基、厌氧培养基等。3 .无菌水制备三角瓶中加200 mL自来水-力口数粒(10-30粒)玻璃珠-加棉塞-用纸包装- 待灭菌。4 .灭菌方法(1)高压蒸汽灭菌1)加压前的准备工作高压锅内加水至水位线 - 放入待灭菌的器皿和培养基 -盖上灭菌器盖 - 打开排汽阀 -接通高压锅电源 -锅内水沸腾- 驱净锅内冷空气 -排气口蒸汽猛烈且微带蓝色-关闭排气阀-加压。2）加压：关闭排气阀 一压力表上压力上升至 1.05 kg/cm2,温度121 C,开始灭菌一恒 温至15-30 m

6、in 一 关闭电源，灭菌结束。3）待锅内温度降至室温时 一打开放气阀一打开锅盖一取出灭菌的物品（注 意不能将包装纸折开，否则已灭菌物品会重新被污染！）（2）高温干热灭菌玻璃器皿和金属器皿包装 一烘有i 160c烘2 h 一关闭电源一待温度降为室温取出 已灭菌的物品。（3）灼烧灭菌接种环：接种针或瓶口可在酒精灯火焰上灼烧达到灭菌效果。5 .细菌总数的测定（1）生活饮用水中细菌总数的测定1）以无菌操作方法用灭菌移液管取1 mL自来水样至灭菌的培养皿中，加入 15 mL约45 c营养琼脂培养基, 立即旋摇平皿。2）同时，再做一个平行样和一个空白样。3）待培养基凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37恒温箱培养24小时，进行菌落计数，即为1 mL水样中的细菌总数。八、实验数据整理1 .配制培养基成分实验记录，见表 3.1表3.1配制培养基成分实验记录序号培养基成分名称数量备注PH2 .高压蒸汽灭菌的实验条件记录，见表 3.2表3.2高压蒸汽灭菌的实验条件记录局压蒸汽灭菌温度工作压力火菌时间备注（待灭菌物品名 称）3 .细菌总数测定记录，见表 3.3表3.3细菌总