芬顿化学对木质素生物质的预处理研究

1、文献翻译芬顿化学对木质素生物质的预处理研究摘要：为了用活化的芬顿试剂模拟白腐菌对木质素解聚的过程，在四种不同的生物质原料中加入芬顿溶液试剂(10 g生物质，176 mmol过氧化氢和1.25 mmol亚铁离子溶于200 ml水中)。实验中，四组生物质原料在芬顿试剂酶糖化作用预处理下，相比于未处理的原料，纤维素解聚率平均升高了212%。在热纤梭菌和拜氏梭菌的连续联合培养实验中，生物质原料在同种芬顿试剂微生物发酵作用预处理下，天然气产量上升了三倍。这些结果表明，芬顿试剂是可行的纤维素预处理手段，能够提高纤维素在生物燃料微生物转化的利用率。引言：世界能源需求逐步上升，但是可用的石油资源持续减少。这种

2、形势导致可持续能源例如木质素植物材料或生物质引起了新的兴趣。生物质原料如奇岗，柳枝稷，小麦秸秆和玉米秸秆都是专用能源植物和农业废料，它们都是可再生能源并且可以用于生物燃料生产。经过微生物发酵过程，生物质转化为生物燃料即乙醇或丁醇。然而，木质纤维素生物质对化学试剂和酶的不亲和性阻碍了微生物发酵过程。木质纤维素生物质由三种主要的聚合物组成：木质素，纤维素和半纤维素；其他聚合物如蛋白质和核算也是组成成分，但不是本研究的重点。纤维素研究热度大是因为它能经过微生物过程转化为生物燃料如丙酮，乙醇和丁醇，而且纤维素被高度利用与造纸工业。然而木质素对纤维素可利用度有负面影响，所以必须通过预处理除去或修改木质素

3、。一个理想的预处理过程不需要减小生物质的粒径大小，应防止纤维素降解并且限制微生物抑制化合物的生成。木质纤维素担子菌纲可以降解生物质中的聚合物并将它分解为两类物质：白腐菌和褐腐菌。在白腐菌如黄孢原毛平革菌，或褐腐菌如密褐褶孔菌处理下，就如经芬顿试剂（亚铁离子/过氧化氢）预处理的体化学预处理过程。这些真菌含有酶类，如过氧化物酶，有些过氧化物酶的催化中心有铁元素，通过亚铁离子催化分解过氧化氢可以缓慢降解木质素，生成羟基自由基，这就是著名的芬顿化学。在尝试模拟白腐菌和褐腐菌的真菌酶时，芬顿试剂提供了一种对有机化合物的非选择氧化性。本次研究的假设及目的即芬顿试剂能加强纤维素的生物可利用性。芬顿试剂有可能

4、为生物燃料生产提供一种直接有效的预处理方法。本次研究将表明芬顿试剂对不同种类生物质原料的预处理效率。木质素的利用和酶解实验将分析芬顿试剂在微生物发酵中使纤维素生物可利用度提高的能力，从而不同种类的生物质原料投入生物燃料生产。2.实验方法2.1实验材料 所有化学反应试剂都不经纯化。四水合氯化亚铁(FeCl2·4H2O)，碘化钾，钼酸铵，氨水，硫酸，淀粉，硫代硫酸钠和过氧化氢(50%)购置于赛默飞世尔科技公司。里氏木霉纤维素酶购置于奥特奇（尼古拉斯维尔，肯塔基州，美国）。制蒸馏水(18 M)配制合适的溶液/稀释液。奇岗，柳枝稷，小麦秸秆和玉米秸秆样品(粒径均小于2 mm)来自迈克尔

5、83;蒙特罗斯实验室的合作者，位于美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学。2.2芬顿试剂预处理在典型的芬顿试剂预处理实验中，10克干生物质(2mm)进一步用市售的咖啡研磨机研磨（汉密尔顿海滩鲜研磨咖啡研磨机模型#80335至62毫米粒径）。生物质加入到1000 ml锥形瓶中，再加入100 ml 12.5 mol/L的亚铁离子溶液(1.25 mmol亚铁离子，或250 mg四水合氯化亚铁)和100 ml 1.76 mol/L的过氧化氢溶液(176 mmol过氧化氢，或6%的过氧化氢溶液)。上述混合物混合后根据各实验条件反应一段时间。过滤后，滤渣在105°C下干燥一晚，滤液保留下来进行后续实验。

6、对照实验按如下进行，在1000 ml锥形瓶中加入10 g干生物质和蒸馏水(18 M, 200 mL);悬浮液根据各实验条件反应一段时间。过滤后，滤渣在105°C下干燥一晚，滤液保留下来进行后续实验。2.3过氧化氢的消耗过氧化氢消耗实验是根据美国过氧化物的公开步骤进行碘量滴定进行的。在不同的几个时间点，从悬浮液中取出1 ml上清液并称重。向该上清液中加入50 ml蒸馏水，4%的硫酸溶液10ml，1%(质量体积比)的碘化钾溶液10 ml，0.4 mol/L的钼酸铵溶液两滴，用0.1N的硫代硫酸钠滴定至浅黄色。加入1%(质量体积比)的淀粉溶液2 ml，滴定至出现蓝色结束。2.4酶糖化酶糖化

7、实验是根据国家可再生能源实验室颁布的协议稍作修改进行的。在一玻璃试管中加入生物质原料，150 mg纤维素酶(活性：56 FPU/ml，由美国肯塔基州列克星敦沃太科科技提供)，5 ml蒸馏水和5 ml pH=5的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液。反应试管在沙浴中加热至50并震荡一晚。葡萄糖含量用购于赛默飞世尔科技（沃尔瑟姆，麻萨诸塞州，美国）的雅培精度X血糖仪和雅培精度X血糖检验试纸测定。2.5木质素的测定酸溶性木质素和酸不溶木质素测定实验是根据国家再生能源实验室步骤进行的。简略地说，在一玻璃培养试管中加入300 mg的生物质，于105°C下烘干一晚，测定总固体的量。向培养试管中加入

8、72%的硫酸溶液2 ml，混合并在30°C下水浴1小时，每10分钟搅拌一次。用4%的硫酸溶液和蒸馏水(18 M)稀释悬浮液，转移至一耐压锅中，在121°C，工作液循环条件下高压煮40 min。然后用无尘定量过滤试纸进行真空过滤，转移中防止物质损失。滤液用紫外分光光度计在20 5nm处测量吸光度，无尘过滤试纸上的残留固体转移至恒重过的坩埚中于105°C下烘干一晚。样品于马弗炉中灰化4小时(575°C)测定酸不溶性木质素。2.6总有机碳含量分析总有机碳含量分析实验用日本岛津公司5000 A的有机碳含量分析仪分析。空白滤液及经芬顿试剂预处理的滤液均以1:3比例

9、用蒸馏水(18 M)稀释。通过工具软件，从总碳量中减去无机碳量，即可得到外标度曲线从而确定总有机碳量。2.7菌株和培养基的组成热纤梭菌ATCC27405来源于Herbert J. Strobel微生物菌种保藏管理中心，肯塔基大学，列克星敦，美国。基础培养基组成是最近通Dharmagadda等人描述。用氢氧化钠调节pH至6.7 。培养基在高压锅中(121°C，104 kPa)煮20分钟，然后再无氧的二氧化碳喷雾中冷却。当液体培养基接近30时加入缓冲剂，碳酸钠(4 mg/ ml)。液体厌氧地分配至血清瓶并用丁基胶塞封口，高压煮至无菌。C热纤维与纤维素一同培养于基础培养基中(63°

10、;C)。拜氏梭菌ATCC51743来源于美国典型微生物菌种保藏管理中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。强化梭菌培养基(RCM; Difco实验室，底特律，密歇根州，美国)是由(每升)10.0 g蛋白胨，10.0g牛肉膏，3.0g酵母膏，5.0g氯化钠，5.0g葡萄糖，1.0g可溶性淀粉，0.5g半胱氨酸，3.0g乙酸钠和0.5g琼脂。RCM是经热压处理，在无氧的氮气中冷却的。液体厌氧地分配至血清瓶并用丁基胶塞封口，高压煮至无菌。拜氏梭菌按常规转移至RCM中(35°C)。2.8微生物发酵对C热纤梭菌的生物预处理在天然气生产容器中进行（(Ankom, Macedon, NY, USA)。

11、将5 g柳枝稷(未处理或经芬顿试剂处理)加入至发酵容器中(有侧口的耐热玻璃瓶，1000 ml)。容器密封并通过测口隔板通入无氧的二氧化碳气流净化。通过侧口的隔板加入50ml基础培养基。接种前容器在65°C水浴锅中加热。通过隔板接种(10%体积比)C热纤梭菌(培养48小时)，在63°C下生长48小时。天然气产量通过Ankom RF气压系统测定(Ankom, Macedon, NY, USA)。在对C热纤梭菌进行预处理后，容器从水浴锅中移出，冷却， 接种(10%体积比)C拜氏梭菌(培养24小时)。继续在35°C下培养48小时。每间隔1分钟测试一次天然气压力，每5分钟测

12、试一次累计压力。在104千帕下设置总压释放。未处理的容器做重复试验。在每个实验中减去未处理的容器的压力值来考察温度对实验的影响。每次天然气生产处理实验在单独一天进行三次。实验数据在SAS v. 9.3中利用ANOVA分析，之后用图基实验测试。(P<0.05考虑显著)。3.结果与讨论3.1基于芬顿试剂预处理的溶液由于生物质的顽抗性，预处理需要增大纤维素转化为生物燃料的效率。各种真菌和化学的预处理过程已经被研究。白腐菌预处理过程在活芬顿化学中利用生物酶产生羟基自由基。这些羟基自由基被证明可以降解木质素。在尝试模拟白腐菌酶降解木质素的过程中，基于芬顿化学的溶液被用于产生羟基自由基，从而达到让纤

13、维素在微生物发酵中更具生物利用性的目标。然而，高浓度的铁和过氧化氢处理会导致纤维素降解和自由基减少，阻碍亚铁离子的反应和更多羟基自由基的形成。此外，研究表明，一组参数的设置并不能优化所有生物质原料的处理。因此，应进行实验测定最佳的过氧化氢浓度，铁的浓度和生物质原料的质量体积比。在酶糖化作用和过氧化氢消耗实验中分析各实验参数。过氧化氢消耗实验（图一）提供了一种观点来分析当生物质用不同量的试剂处理时过氧化氢的消耗量（质量百分数）。芬顿反应是提供电子的氧化物，给一个电子给过氧化氢产生一个羟基自由基，同时过氧化氢被消耗。过氧化氢消耗量的浅坡被认为表明了进行溶液相芬顿化学的最佳反应参数。在这些试验中，在

14、500 ml锥形瓶中加入10 g生物质样品和不同量的亚铁离子（以四水合氯化亚铁的形式）。在零时刻，加入200 ml的1.47 mol/L的过氧化氢溶液开始反应。过氧化氢消耗量被测定为时间的函数（图一）。如预期情况，低含量的亚铁离子(0.05, 0.25 和0.5 mmol; 25, 50 和 100 mgFeCl2·4H2O)在24小时内没有消耗过氧化氢。若没有消耗过氧化氢，可以推测没有生成羟基自由基。然而，亚铁离子浓度为1.25 mmol时(250mgFeCl2·4H2O)，24小时内过氧化氢的消耗量逐渐减少。亚铁离子浓度为2.5 mmol时(500 mg FeCl2&#

15、183;4H2O)，观察到过氧化氢消耗量增加，一小时内耗尽过氧化氢。过氧化氢的快速消耗表明一个小时后羟基自由基已经完全生成，其他化学试剂是可操作的。Michalska et al. (2012)表明再增加反应物的量不能使反应更有效，但可导致副反应和自由基清除剂的产生，从而降低反应效率。在Kang et al. (2002)和Zazo et al. (2005)研究中也包含了自由基清除。为了防止自由基被清除，最佳条件是每10g生物质原料加1.25mmol亚铁离子(250 mg FeCl2·4H2O)为底物比。进行一系列控制实验，确定影响是由于溶液相芬顿化学而不是由于生物质所处的某一反应

16、物或某参数。芒草处于：（1）没有芬顿试剂的水（2）金属水溶液（相同的质量体积比），无过氧化氢（3）不同百分数的过氧化氢溶液，无金属。在酶糖化实验中控制#1,2并没有显示出明显差别(P<0.05)（数据显示无明显差别）。在#3中，向10 g芒草中加入200 ml不同浓度的无金属过氧化氢水溶液，分别是5.42%, 3.17%, 和 1.10% (1.59 M, 0.932 M, 和0.324 M)。24小时内观察到过氧化氢的最小消耗浓度分别为60.21%, 0.14%和 0.03%。缺少供电子的亚铁离子，芬顿试剂不能够起解聚作用。 实验最佳反应物（亚铁离子：过氧化氢）之比经测定为每10 g生

17、物质1.25 mmol Fe2+, 176 mmol 过氧化氢和200 mL 水。此种反应物之比使过氧化氢的消耗量保持稳定，在酶糖化实验中葡萄糖产量增加最大（在3.2节中讨论）。每10 g生物质加1.25 mmol Fe2+与每10g生物质加2.5 mmol Fe2+相比，在一段时间内过氧化氢消耗量逐渐增大，而后者是在某刻快速地消耗过氧化氢，从而降低了自由基清除和副反应的可能性。3.2酶糖化作用建立了反应物浓度后，有必要来分析不同时间(0120小时)的芬顿试剂预处理对纤维素的生物可利用性的影响。酶糖化实验表明，随着芬顿试剂预处理时间的延长，葡萄糖产量上升：0 h, 控制于, 0%, 1 h 2

18、2% (1.22-倍)，3 h 128% (2.28-倍), 24 h 92% (1.92-倍), 72 h 215% (3.15-倍), 120 h 414% (5.14-倍)增加。预处理120小时葡萄糖产量最大。向芒草，柳枝稷，玉米秸秆，小麦秸秆中加入芬顿试剂，根据前面章节确定的芬顿试剂比(10g研磨的生物质，1.25 mmol Fe2+, 176 mmol 过氧化氢 和200 mL水)进行预处理120小时。酶糖化实验表明相比于未处理的芬顿试剂葡萄糖产量有明显增加(P<0.05)。相比于未处理的实验材料，四种生物质经芬顿试剂预处理后葡萄糖产量平均提高了212%：芒草219%(3.19

19、倍)，柳枝稷414%(5.14倍)，玉米秸秆80%(1.8倍)，小麦秸秆133%(2.33倍)，见图二。应用一个学生的t实验，酶糖化作用的显著提高(P<0.05)表明芬顿试剂不同程度地改变了四种生物质原料的性质。然而，一个实验条件对四种原料来说不是最佳的因为每一种木质纤维素生物质原料都有自己的组成。专用能源作物，芒草，柳枝稷的酶糖化实验中产量更大能够说明这一点。然而，芬顿试剂预处理后，四种生物质原料在纤维素的生物可利用性上都有显著提高，表明木质纤维素材料的玩抗性有所减少。木质素实验必须证明，芬顿试剂模拟了真菌在活芬顿化学中降解木质素的方式。3.3木质素实验 既然芬顿试剂预处理后相比于未处

20、理的生物质葡萄糖产量平均提高了212%，那么机理的问题产生了。葡萄糖产量的升高是由于芬顿试剂处理后降解木质素因而纤维素的生物可利用性提高了吗？为了解决这个问题，需进行酸溶和酸不溶木质素实验。图三表明酸不溶木质素含量实验，对芒草，柳枝稷，玉米秸秆，小麦秸秆和未处理生物质进行120小时的芬顿试剂处理。四种原料均表明，相比于未处理的原料，酸不溶木质素的含量平均下降了8.27%。酸不溶木质素下降显著的程度分别是芒草6.63%，玉米秸秆14.1%，小麦秸秆8.76%，而柳枝稷下降3.59%，酸不溶木质素并没有显著下降(P < 0.05)。图三表明酸溶木质素含量实验，对芒草，柳枝稷，玉米秸秆，小麦秸

21、秆和未处理生物质进行120小时的芬顿试剂处理。四种原料均表明，相比于未处理的原料，酸溶木质素的含量平均下降了33.5%。柳枝稷和小麦秸秆的酸溶木质素含量有明显的下降，分别为22.6%和16.8%。而芒草和玉米秸秆相比于未处理的生物质原料，酸溶木质素没有明显的下降，分别为4.61%和0%。酸不溶木质素和酸溶木质素实验表明，对四种生物质原料进行芬顿试剂预处理后，木质素含量有轻微的降低。这些结果不能支持木质素的降解提高了纤维素生物可利用性的假说。必须探索其他机理实验来解答生物可利用性的问题。3.4总有机碳含量酶糖化实验表明对四种生物质原料进行芬顿试剂预处理后葡萄糖产量均有明显的增加。酸不溶木质素和酸

22、溶木质素实验表明对原料进行芬顿试剂预处理后木质素含量有轻微的下降。总有机碳含量实验对未处理的原料，经芬顿试剂处理120小时的芒草和柳枝稷的滤液进行检测，因为芒草和柳枝稷在活体发酵实验中增加程度最大。从经芬顿试剂处理后的生物质原料的滤液中检测到总有机碳含量平均增加了1416 mg/L；这些结果与处理后木质素含量轻微减少是一致的。根据酶糖化实验，酸不溶木质素和酸溶木质素实验，总有机碳含量实验，溶液相芬顿试剂能够降解木质素的假说是不成立的。溶液相芬顿试剂预处理也许不能如同白腐菌在活体芬顿化学中降解木质素一样，但在酶糖化实验中可以看到，它能够以某种方式改变生物质从而使纤维素更具生物可利用性。我们假设芬顿预处理