精确的机械感应装置在基底硬度对细胞牵引力影响的研究(翻译)

1、精确的机械感应装置在基底硬度对细胞牵引力影响的研究Léa Trichet, Jimmy Le Digabel, Rhoda J. Hawkins, Sri Ram Krishna Vedula, Mukund Gupta, Claire Ribrault,Pascal Hersen, Raphaël Voituriez, and Benoît Ladoux细胞迁移在许多基本的生物学的研究中，如细胞生长形态、肿瘤转移和伤口愈合等，都有很重要的作用。细胞在生长时与基底产生的牵引力与基底硬度有直接的关系。最常用的理论是，细胞主要在力传导的地方对基底产生牵引力，称为粘着斑

2、，它的大小至少在初始阶段和细胞基底有一定的关系。事实上，我们的实验数据直接表明了在硬度大的基底上会更快的产生牵引力，基底硬度决定了粘着斑上力的测量结果。在基于主动凝胶理论的唯象模型的基础上，从精确的机械感应机制得出对基底硬度感应的是细胞的骨架而不是细胞本身。精确的机械感应，可以得出在硬度梯度上细胞自适应的迁移。在又硬度梯度的交界线上，我们实验观察到细胞不仅优先迁移到较硬的基底上，而且在窄幅的硬度变化上更明显。综上，这些发现为我们提供了独特的见解来研究细胞对外界刺激的影响和以细胞骨架为基础的硬度感应机制。关键词：肌动蛋白细胞骨架，微制造，生物力学，细胞力学细胞迁移不仅与细胞培养环境中的化学物质有

3、关，还有其机械性能，细胞通过拉动基底直接感应基底的物理特性及其环境。大量资料表明弹性阵列在调节细胞功能有关键性的作用，例如影响细胞粘附性、迁移和分化。这是通过细胞与基底产生肌动球蛋白的力量来感应基底硬度。细胞粘附的机械敏感性质决定了细胞外基质（ECM）影响机械性能的灵敏度。通过粘着斑（FAs）的测量来测量受到的牵引力。文献中报道，FAs的面积和它的动力有一定的相关性。机械敏感性是通过受力后来诱发FAs的触发，研究其中的关系，也可以反过来分析。但是对于细胞的机械敏感性如何感应它的基底硬度换（还）不清楚。在许多研究中也出现了很多相互矛盾的结论。此外，最经典的模型建立和间接观测，表明可以用该收缩肌动

4、球蛋白装置可以作为一个基底硬度传感器。但是从物理的角度来看，周围的基质对响应细胞收缩的变形了解甚少。细胞机械敏感性的合理机制，以为着可以通过有细胞外基质施加应力或应变。力的传导的影响机制也许可以解释细胞在不同基底硬度对细胞粘着、迁移和分化的差异。结果与讨论在不同的基底硬度下，粘着斑和牵引力测量的动态变化。我们通过函数关系，明确的得出这种基底粘着斑核形成和其硬度的关系。本文使用的仪器室是微作用力传感器阵列（FSA）和REF52成纤维细胞的荧光显微镜表达荧光标记的FA蛋白（YFP-桩蛋白）（图1 A和B）。接种REF52细胞稳定表达YFP-桩蛋白在FSA包括各种直径和高度的纤连蛋白涂覆的微柱。这些

5、不同形状的支微微柱导致基底有不同的弹簧常数系数（K从3到80，图1 C），而不改变其分子表面尺度特性。当细胞在基底上贴壁生长5h后，细胞产生的牵引对微柱造成偏转（图1 B）。本文同时分析了牵引力和FAs块随时间的动态变化。作为对照实验，我们比较了细胞在平坦的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的实验（图S1）。正如从以前的研究预期的那样，这些分布是偏向为基材引硬度较大的值。 直径2微米的微柱基底FA的大小没有影响，所以在FAS和平板PDMS基板（图S1）的分布相似。图1通过表达YFP-桩蛋白在微柱基底REF52成纤维细胞的附着力和牵引力。（一）微柱基底的典型REF52细胞扫描电子显微照片（比例尺，1

6、5）（B）单细胞在微柱基底的变形（K为34）。 微柱阵列（红色）用Cy3纤维蛋白标记，YFP-桩蛋白是绿色。 （比例尺，15（C）连续的记录B图中 FASDE 生长和微柱位移变化图像。（比例尺，10微米）（D）显示FA上的PDMS微柱的顶部形成示意图 。（E）力（蓝色）以时间为横轴（在基板K为 34）的函数。分析得出在细胞边缘的分析的牵引力和FA是最大的。在大多数情况下，牵引力和FA随着时间的推移有紧密的联系（图1D和E）：力和FA都随着时间相同的增加（如基底K为34的一个基板上的例子，图1E）。我们设计了一个硬度梯度（480）来验证硬度对FAs的影响。对于每个时间点，我们在不同细胞的FAde

7、 FA的 边缘取平均力F（N5）。平均牵引力（Fk），在桩蛋白位点事施加，增长更迅速，具有较高的硬度（图2A）的硬度达到了较高的饱和度。和牵引力相比，FA面积的增长就不太明显（图2B）。此外，由图2C可知，在硬度范围内，饱和压力Fp 正比于基底刚度。这一结果表明，饱和力对应大约0.840.03微米的基板变形恒定，与之前的其它类型细胞研究一致。有趣的是，力随时间增加的初始速率，dF/dt，还与基板的硬度呈线性变化，使微柱位移等于1.3 nm / s时与硬度无关。总之，这些数据表明的，是由基底的变形调节来验证机械敏感机制的存在。图2，牵引力和粘着动态曲线。（A）平均牵引力与时间在不同基底硬度的函数

8、。细胞数目N5和支柱数目N15。每条曲线前面呈现出快速增长，最后力达到最大。（B）FA面积与时间在不同基底硬度的函数。（C）饱和力金和基底硬度的函数。（D）牵引力的的变化率和基底硬度的曲线图粘着斑面积，牵引力，和压力之间的关系。为了进一步了解牵引力的性质，我们研究作为横轴的基底硬度的函数的力和粘着区面积之间的关系。研究牵引力和FA面积在不同时间点的关系，绘图3A，对于基底硬度从4至80（每个点代表一个平均值大致等于至少15的FA区域）。这个刚度范围从不同的微柱基底对应于一个等效的杨氏模量（2.8至60kPa）。在给定的基底硬度上牵引力和FA区域之间得到一个线性关系。但是对于不同的基底硬度有事结

9、果就不同。用不同力值可以得到同样的FA面积。例如，从3变化到42 刚度范围和从4.7到80（图3A）内的力，获得了相同的面积。事实的FA相似的区域可以对应不同的牵引力，如图 3 C和D，与文献的结果吻合。 其中被发现一个变异的FA在不同的位置之间的应力，但仅用于一个给定基底硬度。这些结果与FA 机械敏感性机制整体对比，假定一个恒定应力是通常普遍接受的理解。有趣的是，这个零线性关系引起了非零的牵引力。这种观察可以通过另一种机制来解释FA的张力比0.3小 。这个是残留面积0.3焦配合物的典型尺寸 类似，这就能够承受较大的牵引力而不与附加其他力。图 3，牵引力和粘着区域之间的关系。 （A）FA面积在

10、各时间点的平均力在不同刚度的图像。 （B）这个刚度范围从不同的微柱基底对应于一个等效的杨氏模量，2.8至60kPa。在34之下快速增加硬度，随后通过缓慢增加到80。（C和D）一个REF52细胞从软基板（12）上和较硬的基板（54）上生长的典型例子。 微柱是红色、桩蛋白绿色。FAs的大小（比例尺，8微米）。（力比例尺，10 nN）。然后，定义应力（）为力除以FAs面积。应力对应于不同的曲线，代表有不同的力和FAs面积的关系对应，如图3A。通过绘制应力和硬度的函数 （图 3B），我们发现应力并不是保持不变，而是硬度的递增函数。这种关系与佩勒姆和王 的研究结果吻合。更确切地说，我们可以把压力提高7

11、(1=1kPa)在硬度在34以下时,通过在更高硬度的饱和段进行调节。在以往的研究中,Balabanet得出结论认为细胞粘附的机械调节受恒定的压力，但他们仅在一个单一的刚度进行实验。我们的确发现他们的研究结果（图 3B）中使用的基底硬度的应力和硬度关系有一定的关联。综上所述，我们的数据表明不是因为先前报道机械敏感机制的影响不是 FAs的影响，但需要精确的机制来研究。精确机械敏感机制建模仿真分析。应用于牵引力和FA的形成在分子尺度形成引起的弹性变形它的一些组成蛋白质的组织变革，这反过来又可以提高新的蛋白质具有约束力的生长触点。这样的机制，依赖于粘接剂的局部刚度和基底亚微米尺度，其对应本文中，将PD

12、MS的弹性的表面，也就是说，它的杨氏模量（），其特征在于微柱的顶部（在我们的唯象模型的SI Text中有详细介绍）。因此，如果机械反馈是由FA本身决定的，然后由FAs施加的压力将取决于而不是k。然而，我们在这里计算的应力，取决于在微柱的弹簧常数系数（对于相同）。这样依赖关系表明，必须反馈参与涉及的结构和其他额外的FAs。我们建议这一反馈机制是精度更大范围的细胞骨架，特别是FA上纤维应力。我们现在讨论一个骨架的变形，通过细胞骨架作用对应力产生活性影响。通常，这种机械活化框架内可以理论分析粘弹性凝胶活性。这个唯象理论得出平衡理论，如细胞骨架，存在活性应力（肌动蛋白/肌球蛋白收缩）和向列顺序参数的肌

13、动蛋白丝的局部方向成正比。从到耦合，这是在列相的凝胶标准，则意味着该应力耦合取决于和应。变换句话说，变形x 包括一个应力和，因此重组纤丝，这反过来又产生了主动的压力。对于这种对到应力耦合，该的松弛时间是很长，这意味着弹性细胞骨架流体变形学一样。事实上，细胞骨架的流变学是已经观察到非常复杂，但是仅响应到一个瞬时拉伸。我们有理由假设本文的情况是一个持续的约束，其中已经报道应变硬化和长期松弛时间。基底硬度对细胞运动的方向性的影响。通过细胞骨架的极化驱动这样一个大规模的机制，也可以提供细胞迁移一个合理的解释。我们观察到，在更快的牵引力的增长和在硬度更大的基材有更高的饱和力值，并增加压力相对于基板的刚度

14、，使我们自然地有以下预测：极化的细胞从一个更软的基体来会突然产生大的牵引力，因为他们接触到坚硬的一面，而旋转到垂直迁移到硬基质。另一方面，细胞从僵硬侧来将保持的边界。这些预测为指导的迁移的设计实验。从软到硬，反之亦然在同一创建移动微柱基底。这种基底组成的直径为1和2的微柱连续阵列，使得刚度比大约为10（KS / KS10），而微柱表面密度保持不变（图5A）。细胞从柔软的部分，或从僵硬的一部分来进行分别考虑考虑。如该图所示， 图5D设计基底硬度从3到34，细胞确实在向的硬度部分对准垂直于边界移动。接下来，使用上述测定法来分析不同刚度的微柱底单个细胞的迁移路径。通过计数细胞的择优取向后，他们碰到的

15、边界对这两个不同的部分衬底的进行了硬度趋向进行了分析。我们测量的数对应的是细胞从软基板到来，到达边界（）。通过改变软微柱从3134的硬度，我们得到最佳迁移效率大约硬度值为3-10大约有70的细胞走向更硬的一侧（图5B）。叉k，没有观察到到优先方向（只有35-50的细胞迁移朝着更严厉的基板）。与此相反，大多数细胞位于较硬方向没有检验迁移到坚硬的微柱（直方图，图5C）。另外，作为对照实验测试细胞是否真正反应以在基板的刚性和不粘附的几何形状，我们制作粘合面与上涂有荧光标记的纤连蛋白（图S2）的玻璃盖玻片上相同的几何形状，为了限制细胞粘附到在基片转印图案，然后用处理过的聚乙二醇以钝化表面的其余部分呈现

16、不沾。在这些条件下，我们得到的数组的纤连蛋白斑块印刷到玻璃具有相同的粘合剂表面和尺寸为支柱的顶部。在这样的表面呈现相同的几何形状，但没有刚性依赖，我们观察到的几何不能解释我们对以前的结果支柱基板。事实上，只有37的细胞从1到2迁移到那些区域，并在53的区域当第一次放置在面积为2方向相反。当基片的两侧提出了一个刚度较大围绕50，我们观察到细胞的迁移朝更硬的部分减少了，仿佛细胞不能感觉到任何两侧（图5B）之间的差异。换句话说，最佳的应于在应力在基体刚性的台阶差内出现窄幅变化。这些结果可能与该细胞以适应他们自己的刚度。此外，朝更严厉的端迁移呈正相关到的应力刚度关系的初始制度（即应力增加达到饱和之前，

17、见图 3B）。通过分析微柱于变形迁移活动在柔软和坚硬的基板之间（图5）边界活动，我们发现，作为一个单元从柔软的部分来被探测的接口，力迅速上升到30nN（图5F），导致向硬的区域迁移胞体（图5E）。在与我们之前的结果一致，这种行为可以归因于细胞沿该轴极化，而迁移从软到硬。看来，当刚度的步骤相对应的大量增加朝着更硬的部分迁移能力增强。根据图3B，硬度从1和50之间的范围变化对应于细胞基底硬度感应。然而，如果基板的两侧对应于类似应力的贴壁细胞产生的值，无论什么刚性，细胞从一个侧面不迁移。当细胞感知僵硬的一面，细胞发挥更大的力从而可能诱导肌动蛋白的极化和细胞骨架硬的一面迁移。在这里得出，这种限制可以通

18、过的相对变化来确定细胞双方发挥应激反应。图5细胞微柱基底上的迁移。 （一）扫描电子显微照片显示微柱表面表现出不同刚度的细胞扩散图。微柱的直径为1（顶部区域）和2（底部区域）。细胞从基底柔软朝硬的方向迁移（比例尺，10微米）（B）基底的弹簧系数从3 到134，细胞从软基底到硬基底的迁移图，红色的表示在硬基底的细胞数目，蓝色为在软基底上。（C）基底的弹簧系数从34 到14000，细胞从硬基底到软基底的迁移图，红色的表示在硬基底的细胞数目，蓝色为在软基底上。说明细胞更喜欢硬基底（D）REF52细胞的在硬（34）和软（3）基板之间的运动明视场图像。虚线表示边界。（比例尺，20微米）（E）REF52细胞从软到硬基质动力分配。 微柱红色，细胞蓝色 （比例尺，5m）细胞柔软和坚硬的基板（1微柱与2微柱）之间的边界呈现在柔软的部分势力的大致均匀分