临床常见细菌的手工鉴定和结果判断概要

1、临床常见细菌的手工鉴定和结果判断一. 细菌的鉴定步骤1 1、鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有 已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。2 2、对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板 上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都 是预先纯化培养）3 3、对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（Gc,Gc, Gb,Gb, GcGc, GbGb）, 做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待 鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单 的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。4 4、按鉴定质控单的要求填写好病人姓

2、名，年龄，性别；标本类型， 标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落 形态以及有无溶血。5 5、复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。.革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色 方法。首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变 细菌对染料的通透性）。第一步：以结晶紫初染（染色液I）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液H）第三步：用 95%95%醇脱色（染色液皿）第四步：最后用稀释复红复染（染色液W）.触酶实验（H H2Q实验）:a.a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初 生态氧，继而形成氧分子出现气泡。b.b. 方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净

3、的玻片上涂开， 滴加3%3%氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳 性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验， 这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假 阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。c.c. 阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要 避光置4 4C冰箱保存。d.d. 应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实 验阳性，链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用 于区别葡萄球菌属（+ +）,微球菌属（+ +）,链球菌属（）。 .氧化酶实验（KovacKovac 实验）：a.a.原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统

4、的最终呼吸酶。酶并不直接与试剂（1 1 醯酸四甲基对苯二 胺）起反应，而是首先使细胞色素 c c 氧化，然后氧化型细 胞色素 c c 使对苯二胺氧化，出现深兰色反应。b.b.方法（滤纸法，菌落法，试剂纸片法）：一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许， 加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色。结 果读取在 1 10 0秒钟时为最佳，6060 秒内读取可靠。本实验避 免接触含铁物质（假阳性），也不能在含糖培养基上生长 的菌落进行实验（假阴性）。c.c.阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。d.d.应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌 属和肠杆菌，前者阳性，后者

5、阴性。二.葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌， 表皮葡萄球菌，腐生葡萄 球菌。1.1. 形态与染色：葡萄球菌直径 0.50.51.51.5 卩 m m 菌体圆形，呈单个， 成双以及不规簇状排列。染色呈紫色，为革兰阳性球菌。2.2. 与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球 菌。3.3. 与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验（操作方法同 甘露醇OFOF 试验）为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外咲喃唑 酮（即痢特灵 5 50 0卩 g/g/片）敏感实验

6、微球菌为耐药，而金黄色葡 萄球菌为敏感。4.4.葡萄球菌属的种间鉴定:（1）.菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄 色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落 大多数为白色，也有部分为柠檬色或深黄色。.溶血毒素：金黄色葡萄球菌有a、B、Y、3溶血毒素, 各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围、抗原性及溶血 时的温度等。其中以a溶血毒素为主。而其他葡萄球菌大 多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。.血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌邙日性），表 皮葡萄球菌（阴性），腐生葡萄球菌（阴性）。血浆凝固酶 是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种。血浆 凝固酶

7、检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般采用 玻片法。a.a. 操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血 浆乳化，结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在 金黄色葡萄球菌表面发生凝集，所以我们肉眼能看见凝集颗 粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄 色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反应因子（类似凝血酶的一种物质）作用，形成复合物再使纤维蛋白 原转化成纤维蛋白而发生凝集。试管法主要由游离凝固酶作 用产生。b.b. 注意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观察；凝固 酶阳性要做自凝阴性对照（用生理盐水代替血浆），只有在 阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性，

8、有一部分葡萄球 菌有自凝现象。.新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5 5 卩 g/g/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则 对之耐药。抑菌环直径16mm16mm 即为新生霉素敏感。.甘露醇氧化发酵实验：a.a. 操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加，放3 37 7C孵箱内 181824h24h 后观察结果。b.b. 结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露 醇。若两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色， 没加石蜡管变黄色则为氧化型；如果两管都不变色则说明该 细菌是不利用甘露醇（产碱型）。c.

9、c. 应用： 金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘 露醇 （即两管都变黄色）；表皮葡萄球菌需氧部分产酸，厌 氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加 石蜡管不变黄色）；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。三. 微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌。鉴定生化见下表微球菌属的种间鉴定易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球菌色素产生黄色黄色+粉红色需氧葡萄糖产酸+硝酸盐还原+一脲素酶d dd d+氧化酶一+/ / +（弱）新生霉素敏感S/RS/RS SR Rd d :不定 S S :敏感 R R :耐药四. 链球菌属1.1.形态和染色：链球菌的直径为 0.50

10、.5 1.01.0 卩 m m 呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛， 没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽 端相对，尖端向外。2.2.根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：甲型 （a- -）溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；乙型（P- -）溶血，即菌落周围出现较宽的透明溶血环； 丙型（丫- -）溶血，即菌落周围无溶血环。3.3.根据抗原结构（C C 多糖抗原）的不同可分为 A A、B B、C C、D D、E E 、F F、G G、H H、K K、L L、M M、N N、0 0、P P、Q Q、R R、S S、T T 等 1818 个群，

11、对人 类有致病者 90%!90%!于 A A 群，偶见其他群链球菌致病。4.4.链球菌属的种间鉴定.乙型溶血链球菌的鉴定：a.a.对杆菌肽（0.04U/0.04U/片）（抑菌圈直径10mm10mm 敏感： A A 群链球菌（主要为化脓性链球菌）。b.b.对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸 钠水解实验、CAMCAM 实验阳性：B B 群链球菌（主要为无乳 链球菌）。c.c.对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，CAMCAM 实验阴性：主要为马链球菌、类马 链球菌、兽疫链球菌；对三者的区别实验要加做海藻糖 和山梨醇实验。d.d.CAMPCAMP 实验：将能产生B- -

12、溶血的金黄色葡萄球菌在 血平板上划一横线接种， 再将待鉴定菌于金黄色葡萄球 菌3m3mn n处垂直种一短线，若在有 COCO 条件下培养 5 56 6 小 时，或无 COCO 条件下培养 18182424 小时，在两细菌连接处 出现一个半月型的加强溶血区即为 CAMCAM 实验阳性。.甲型溶血链球菌的鉴定：a.a.草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣( OptoOpto chinchin )不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴 性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌，轻型链球菌， 血链球菌，唾液链球菌等。b.b.肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌，其他链球

13、菌略大；在血平板上 菌落细小、圆形、表面光滑、灰白色、半透明，开始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣( OpOp tochintochin )敏感。奥普托欣(OptochinOptochin )含量为 5 5 卩 g/g/片， 抑菌环18m18mn n为敏感，15mn15mn 为不敏感，151518mn18mn 应重 复实验。.肠球菌(D D 群链球菌)的鉴定：溶血不定，主要是a- -、丫 - -溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性；若能在 6.5%NaCI6.5%NaCI 的心 浸液肉汤中生长即为 D D 群肠球

14、菌，不能生长为 D D 群非肠球 菌。.链球菌属鉴定的系统生化结果判断a a.1%1%美兰牛乳b.b.胆汁七叶苷实验：变黑为阳性。c.c.PH9.6PH9.6 肉汤实验：变浑浊为能在碱性环境中生长邙日 性）。d.d.6.5%NaCI6.5%NaCI 心浸液肉汤： 由紫变黄为能在高盐环境中 生长 （阳性）。e.e.精氨酸双水解酶实验：变红色（对照不变色，仍为 黄色）为性五. 奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏 菌属只有卡他布兰汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力，氧化酶及触酶均阳性。培养时对营养

15、要求高，能在巧克力平板或有丰富营养的血平板上， 在 5 51 1 0%C0%C2环境中生长。.鉴定过程：a.a.DNADNA 酶实验阳性为布兰汉氏菌，阴性则为奈瑟氏菌。b.b.能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c.c.能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌.几种主要细菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的氧化分解产酸结果如下:氧化分解产酸菌种葡萄糖麦牙糖蔗糖淋病奈瑟氏菌+一脑膜炎奈瑟氏菌+粘液奈瑟氏菌+卡他布兰汉菌DNADNA 酶实验:a.a.方法：将待鉴定细菌点种于含 0.2%DNA0.2%DNA 勺 DNADN

16、A 琼脂平 板上，培养后用 1mmol/LHCI1mmol/LHCI 覆盖平板，菌落周围出现透 明环者为阳性。b.b.原理：某些细菌能产生 DNADNA 酶，可使 DNADNA 长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链DNADNA 可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在DNADNA琼脂平板加盐酸，可在菌落周围形成透明的溶血环。（肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生 DNADNA 酶，阳性球 菌中只有金葡菌能产生 DNADNAB。）六. 肠杆菌科肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，其中对人致病性较强的鼠疫耶尔森菌（现已基本没有流行）和伤寒沙门菌；4 4 类常引起

17、腹泻和肠道感染的细菌（埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、耶 尔森氏菌）和 8 8 种常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌 属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属 和摩根菌属）。另外还有很多细菌是肠道的正常菌群，但在一定条件 下也可致病（条件致病菌）。实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验，阴性为肠杆菌科细菌；阳性的为非发酵菌（我们实验室还没有简单的系统鉴定方 法，一般要仪器上卡检测）或弧菌科细菌。1 1.肠杆菌科的系统生化.KIAKIA 试验（克氏双糖铁）组成：乳糖/葡萄糖=10=10/1 1 （斜面/高层，其长度最好是都是 2CM2CM结果判断：斜面或高层变黄色

18、：阳性；不变色（红色）：阴性高层中出现裂隙：产气阳性高层中出现黑色（FeSFeS）:产 H H2S S 阳性.苯丙氨酸脱羧酶试验细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成 苯丙酮酸，再与 10%10%勺 FeClFeCl3试剂产成深绿色反应。（变 形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属为阳性，其他为阴 性）.枸橼酸盐试验（碳源利用实验）在枸橼酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐， 分 解后生成碳酸钠，使培养基变碱性， pHpH 指示剂溴麝香草 酚蓝由淡绿色变为深兰色，即为枸橼酸盐试验阳性。 （埃 希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性） 注意：接种时不能被糖，蛋白胨污染，要单独

19、接种）.甲基红（MRMR 试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养基的 pHpH 下降至 4.54.5 以下 时，加入甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳性； 变红 色为阳性。培养基成分：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红 0.1g0.1g，酒精 300ml300ml，水 200ml200ml主要用于大肠埃希菌（+ ）和产气肠杆菌（）的鉴别；常与 V-V-P P实验联合使用，一般情况下两者结果正好相反， 但也有例外如奇变两者同为阳性。.MIUMIU （动力靛基质尿素）试验1.动力：在半固体培养基中穿刺接种细菌培养后，若穿刺线周围有细菌扩散生长， 则为动力 （+）

20、 ;清晰则 为动力 （一） 。2.靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸生成吲哚。吲哚再与试剂对位 二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而呈红色。3.尿素试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱，再使培养基中的指示剂（0.0.4%4%酚红）变红色即为阳性。.硝酸盐还原试验NONOT NQ-NQ-（大肠）NQNQ NHNH+NONOT N2（沙雷氏菌属）试剂甲：对氨基苯磺酸试剂乙：a- -萘胺观察结果时甲液和乙液要等量加入， 立即或 10min10min 内出现 红色为阳性。若不变色，则要加入锌粉：变红色，说明 硝还试验为真阴性仍不变色， 说明硝还试验真

21、阳性，但 原先还原产物不是 NQNQ。阴性结果出现时有三种可能：细菌不能还原硝酸盐亚 硝酸盐继续分解生成氨或氮培养基不适合细菌生长 肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐.氨基酸脱羧试验细菌产生脱羧酶分解氨基酸使其脱羧生成胺和COCO,虽然各种细菌所产生的脱羧酶不一定相同，但最后都能生 成胺（赖氨酸T尸胺，鸟氨酸T腐胺，精氨酸T精胺） 和 COCO。然后胺能使培养基变碱性，通过指示剂（溴甲 酚紫）由黄变紫即为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。 注意：微量管接种好后要加石蜡，使培养基造成厌氧 环境。（生成的胺更稳定，还能诱导氨基酸脱羧酶的产 生）对照管如果不显黄色，则结果不能判断。应用：除伤寒沙门氏

22、菌，鸡沙门氏菌外，其他沙门氏菌鸟 AAAA 赖 AAAA 均为阳性；除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志 贺菌也菌为阳性。.葡萄糖酸盐试验微量管在培养 181824h24h 后，加班氏试剂，水浴煮沸 1010 minmin,由兰色变黄绿色到砖红色即为阳性， 不变为阴性。1 1.肠杆菌的鉴定流程.根据苯丙氨酸脱羧酶实验：（ + ）：变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根氏菌属（）:埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，枸橼酸 杆菌属，爱德华菌属；克雷伯菌属，肠杆菌属， 沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属。.苯丙氨酸脱羧酶实验阴性，加做葡萄糖酸盐实验（ + ）:克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚 菌属a.a.动力（一

23、）：克雷伯菌属，属内种的鉴定主要 根据吲哚试验（肺克吲哚实验阴性，三个亚种鉴别 试验 IMViCIMViC:肺炎 + + ,臭鼻+ d d,鼻硬结 + ）b.b.动力（ + ）, DNADNA 酶（ + ）:沙雷氏菌属动力（ + ）, DNADNA 酶（），枸橼酸盐（ + ）:肠 杆菌属（主要是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌，前者赖 氨酸阴性，而后中为阳性）动力（ + ）, DNADNA 酶（），枸橼酸盐（）：哈 夫尼亚菌属（）：加做 IMViCIMViC （靛基质- -甲基红- - VP#VP#句橼酸盐）试验a.a.IMViCIMViC （I）:大肠埃希菌 （ H H2S S ）或 爱德华菌属（HS

24、HS+）。b.b.IMViCIMViC+ + ）:枸橼酸杆菌属.苯丙氨酸脱羧酶实验阳性，根据产 HSHS 可分（ + ）:变形杆菌属属内主要鉴定试验如下普变奇变产粘变潘尼氏尿素酶+鸟氨酸一+一一靛基质+一一一麦芽糖一一+木糖+（）:普罗威登氏菌属，摩根氏菌属普罗威登氏菌属：鸟氨酸：；枸橼酸盐：+ （属 内鉴定尿素酶及一些碳水化合物的产酸试验， 如甘露醇、阿拉伯糖、海藻糖等）摩根氏菌属：鸟氨酸：+;枸橼酸盐：（只有一个种：摩氏摩根氏菌）.志贺氏菌属和沙门氏菌属这两种菌属在肠道选择性培养基（SSSS 麦康凯）形成不发酵乳糖的透明或半透明的无色菌落， 但一些沙门氏能 产 H H2S S就会形成中心黑

25、色的菌落，鉴定时在选择性培养基 上挑选可疑菌落进行鉴定。a a.志贺氏菌属主要系统生化：KIAKIA: K/AK/A （只有福氏 6 6 型能产气），H H2S S （）; MIUMIU +/-+/-;苯丙：；枸橼酸盐：。报告结果时要根据其血清学的结果鉴定到种，即A A 群（痢疾志贺氏菌）、B B 群（福氏志贺氏菌）、C C 群（鲍氏 志贺氏菌）、D D 群（宋氏志贺氏菌）；我国主要以 B B 群和 D D 群为主。b b.沙门氏菌属主要系统生化：KIAKIA: K/AG,K/AG, H H2S S （ +/+/-）; MIU:MIU: + ;苯丙：；枸橼酸盐：。伤寒沙门氏菌的抗原结构：菌体抗

26、原（0 0 抗原），鞭毛 抗原（H H抗原），包膜抗原（主要是 ViVi 抗原）根据系统生化鉴定到沙门氏菌属后，在根据其抗原结构的特点，用血清学凝集分到种即可报告结果。血清凝集步骤如下：A-FA-F 多价 0 0（ + ）:0 02, HaHa（ + ）: A A 群（甲型副伤寒沙门氏菌）0 04, HbHb （+ ）: B B 群（乙型副伤寒沙门氏菌）0 06、7, He,He, ViVi （ + ）: C C 群（丙型副伤寒沙门氏菌）0 09, Hd,Hd, ViVi （ + ）: D D 群（伤寒沙门氏菌）0 03、io, HehHeh（ + ）: E E 群0 0ii, HiHi （

27、+ ）: F F 群A-FA-F 多价 0 0 （）,做 ViVi 血清因子凝集：（ + ）浓菌液 沸水煮沸 30min30min,再用 A-FA-F 多价 0 0 血清定群；（）继续 以 A-FA-F 以外的多价 0 0 血清凝集分型。血清凝集注意：确定 0 0 群后，一定要用 H H 因子再做凝集;最终结果要以凝到 H H 相后才能报告。七.非发酵革兰阴性杆菌非发酵革兰阴性杆菌是指一群不利用葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌。氧化酶试验一般阳性，除不动杆菌属和嗜麦芽假单胞菌外。非发酵菌按下列试验进行初步分属菌属况触酶氧化酶0-F0-F试验动力MaCCMaC

28、C 生长情假单胞菌属+0/0/一+/ / 生长+无色杆菌属+0/0/一+/ / 生长+不动杆菌属一0/0/一一生长+产碱杆菌属+一+生长+摩拉菌属+一一不生长+金氏菌属+F F（弱）一不定黄杆菌属+F F（弱）不生长+下面主要讲一下铜绿假单胞菌：在血平板上形成的菌落大而扁平、 湿润、有金属光泽，有生姜味的灰绿色或兰绿色的菌落，并有明显 的溶血环。常有色素产生（绿脓素，青脓素，红脓素，黑脓素等）， 在 MHMH 平板上更加明显。铜绿假单胞菌的最低鉴定标准：动力+氧化酶+枸橼酸盐+氧化分解 GLUGLU 木糖不利用麦芽糖赖、鸟氨酸脱羧酶试验- 精氨酸双水解酶试验+H H2S S。八.棒状杆菌属棒状

29、杆菌属是一群革兰阳性杆菌。菌体大小长短不一，常一端 或两端膨大呈棍棒状。大多数存在于水和土壤中，其中有的是人和 动物粘膜上的正常菌群，若是从无菌部位分离到棒状杆菌，应予以 鉴定（如宫颈拭子）。在血平板上能生长，但生长不良好，菌落细小，湿润。鉴定：根据触酶和有无溶血，可分：.HQ+,HQ+,无溶血：白喉、假白喉、溃疡、干燥、假结核、马棒、牛棒；.H H2Q Q ,有溶血：溶血棒、化脓棒、阴道棒.加做葡萄糖，麦芽糖，蔗糖产酸试验，结合和标本类型，基本上可以鉴定到是哪一种棒状杆菌。药敏试验方法：一、K-BK-B 法：1 1、从孵育了 16-2416-24 小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直

30、 接用生理盐水制成 0.50.5 麦氏单位。2 2、在 1515 分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处 旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。3 3、用棉拭子在无菌的 M-HM-H 培养基表面化线接种，再重复操作两次， 每次将平板转动 6060 度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用 棉拭子涂抹平板的边缘。4 4、将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个纸片中心间距24mm24mm 纸片一旦与平板接触，不应再移动。5 5、贴完纸片后，应在 1515 分钟内放入 3535 度孵箱。嗜血杆菌属，链球 菌属放入3%-5%3%-5%勺

31、 CQ2CQ2 烛缸。6 6、孵育 2424 小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与 NCCLSNCCLS 手册比 较，作出结果判断。说明：细菌药敏结果的判断以 NCCLSNCCLS 为标准，所以药敏试验的每一步 都应严格按照 NCCLSNCCLS 操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流 感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-BK-B 法. .肺炎链球菌胶乳凝集测定法 1 1、在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。2 2、从冰箱取出鉴定试剂 （SlidexSlidex pneumo-kitpneumo-kit） 于室温。3 3、在其中一滴生理盐水上滴加 R1R1 试剂，在另

32、外一滴上滴加 R2R2 试剂, 用搅拌棒混匀。4 4、轻轻晃动玻片 2 2 分钟，观察结果。5 5、2 2 分钟内，女口 R1R1 出现凝集为阳性；女口 R1R1、R2R2 均未出现凝集为阴 性。注：R3R3 为阳性对照。二、药敏纸片的选择1 1 、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头孢噻肟（CTX0CTX0 头孢唑林（CZCZ 头孢他定（CAZCAZ 氨苄西林（AMAM 哌拉西林（PIPPIP）阿米卡星（ANAN 头孢噻吩（CFCF 环丙沙星（CIPCIP）头孢他定/ /克拉维酸（ CAZ/CACAZ/CA 哌拉西林/ /三唑巴坦（ PIP/TZPIP/TZ 羧苄青霉素（ CBCB 亚安培南 头孢匹肟

33、（ FEPFEP 头孢克罗（ CECCEC头孢呋辛（ CXMCXM 头孢噻肟 / / 棒酸（ CTX/CACTX/CA庆大霉素（ GMGM奥格门丁（ AMX/CAAMX/CA2 2、铜绿假单孢菌/ / 不动杆菌妥布霉素（ TMTM阿米卡星（ ANAN安曲南（ AZTAZT头孢哌酮（ CFPCFP哌拉西林（ PIPPIP头孢匹肟头孢噻肟（ CTXCTX环丙沙星（ CIPCIP头孢他定（ CAZCAZ左旋氧氟沙星（ OFLOFL） 亚安培南哌拉西林 / / 三唑巴坦3 3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（ OXOX） 青霉素 G G（ P P） 头孢唑林（ CZCZ） 阿米卡星（ ANAN）红霉素（E E

34、）头孢噻肟（CTXCTX 环丙沙星（CIPCIP）头孢噻吩（CF）万古霉素 奥格门丁（ AMX/CAAMX/CA 哌拉西林/ /三唑巴坦4 4 、肠球菌氨苄西林（ AMAM）万古霉素环丙沙星（ CIPCIP）庆大霉素（ GMGM）红霉素（ E E）氧氟沙星（ OFLOFL）5 5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（ AMAM）头孢噻肟（ CTXCTX）万古霉素红霉素（ E E）氧氟沙星（ OFLOFL） 克林霉素 （CMCM）肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌 ESBLsESBLs 的检测MHMH 培养基上贴头孢他定，头孢他定/ /克拉维酸，头孢噻肟/ /棒酸，安 曲南。如头孢他定的抑菌圈22mm

35、22mm 安曲南27mm27mm 头孢噻肟27mm27mm 意味可 能有 ESBESBL L护生。如头孢他定 / /克拉维酸与头孢他定， 头孢噻肟/ /棒酸与头孢噻肟的差值5mr5mrp则确证 ESBLESBL 护生。耐药机制 。一代头孢对普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、肠球菌、假单孢菌属、沙雷氏菌属、拟杆菌属无效。第二代头孢对假单孢菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属、肠球菌无效；肠球菌对头孢类天然耐药。氨基糖甙类抗生素阿米卡星与庆大霉素不完全交叉耐药。 红霉素类、 四环素类等抗生 素内部有相互交叉耐药。金黄色葡萄球菌耐万古霉素、 无乳链球菌耐青霉素和氨苄青霉素、 无 乳链球菌和 D D 群链球菌耐万古霉

36、素和替拉考宁为不可能的表型。 洋葱伯克霍德菌对氨基糖甙类、亚安培南天然耐药。 除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外， 替拉考宁耐药的凝固酶阴性的葡 萄球菌不常见。金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药为罕见表型。 氨苄青霉素对非发酵类不宜应用。对于葡萄球菌，苯唑西林耐药，青霉素敏感是不可能的。NCCLNCCL 关于细菌药敏实验的说明总评论：1 1、头孢噻吩可以代表头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、和头孢羟氨苄。但是，头孢唑林、头孢呋辛、头孢泊肟、 头孢丙烯应单独测试， 因为某些对这些药物敏感的菌株对头孢噻吩是 耐药的。2 2、利福平不能单独用于化疗。肠杆菌科1 1、 对于沙门菌属和志贺菌属只

37、有氨苄西林、喹诺酮、和甲氧苄啶 / / 磺胺甲恶唑可用于常规试验与报告。 初此之外， 对于沙门菌属和志贺 菌属的肠道外分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。2 2、 克雷伯菌属和大肠艾希菌的产 ESBLSESBLS 株对青霉素、头孢菌素类或 安曲南临床治疗可显耐药性， 尽管在体外药敏试验对其中某些抗生素 敏感。对于所有产 ESBLSESBLS 株，应报告为耐所有青霉素类、头孢菌素及 安曲南。3 3、随着 3 3 代头孢菌素的治疗，肠杆菌属、枸橼酸菌属和沙雷菌属可 发展其耐药性。 最易敏感的菌株在开始治疗 3-43-4 天就可变为耐药， 因 此要反复测试这些菌株。葡萄球菌1 1、青霉素敏

38、感的葡萄球菌对 FDAFDA 批准的用于葡萄球菌感染的其他青霉素类、 头孢菌素和碳青烯类也是敏感的。 青霉素耐药而苯唑西林敏 感的菌株对（3 -内酰胺酶不稳定的青霉素是耐药的，但对其他（3 -内酰胺酶稳定的青霉素、3- -内酰胺酶抑制剂复合药、相关的头孢类和 卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐药的葡萄球菌对现在可用的所有3- - 内酰胺类抗生素是耐药的。 因此仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知 一大批3- - 内酰胺类抗生素的敏感性与耐药性，不必常规测试其他青 霉素类、3- -内酰胺类抑制剂复合药、头孢类和卡巴陪南类。2 2、绝大多数的 MRSMRS 对多种抗生素耐药。包括3- -内酰胺类、氨基糖 甙

39、类、大环内酯类、克林霉素和四环素。观察到多重耐药应该是对甲 氧西林可能耐药的线索。3 3、长期应用喹诺酮类治疗的过程中葡萄球菌可发展其耐药性，因此 应重复测试耐药性。肠球菌1 1、对于肠球菌属， 头孢菌素、 氨基糖甙类（除了筛选高水平耐药性） 、 克林霉素和甲氧苄啶 / / 磺胺甲恶唑在体外可能有活性，但临床无效， 因此不能报告细菌对这些药物敏感。2 2、青霉素敏感性可以用于不产B- -内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄西林 / / 舒巴坦、阿莫西林 / / 克拉维酸、 哌拉西林以及哌拉西林 / /三唑巴坦的敏感性3 3、氨苄西林是氨苄西林和阿莫西林类的代表药。氨苄西林的

40、结果可 用来判断不产（3- -内酰胺酶的肠球菌对阿莫西林/ /克拉维酸和氨苄西 林/ /舒巴坦的敏感性。4 4、青霉素的结果可预测不产3- -内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿 莫西林、氨苄西林 / /舒巴坦、阿莫西林 / /克拉维酸、哌拉西林 / /三唑巴 坦的敏感性。5 5、 对于血和脑脊液分离株需用头孢硝噻吩3- -内酰胺酶试验，阳性 提示对青霉素耐药，同时对酰胺基、羧基和脲基青霉素耐药。 细菌鉴别要点：1 1、革兰阳性球菌所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌， 阴性为链球菌科。 但不排除 例外，气球菌为弱阳性。粪肠球菌偶有阳性。操作触酶试验应尽量避 免用铂金取菌

41、环（针）在 H H2O O2上涂菌，而应先涂菌，在滴 H H2O O,步骤 不能颠倒。因为铂金可以和 HCHC2产生假阳性反应。H H2O O2必须新鲜，若 放置过久或暴露于光线下容易分解，必须保存于 4 4C冰箱。实验所用 菌须大量，不可挑到琼脂，会产生假阳性。对触酶阳性的革兰阳性球菌，应继续做玻片法血浆凝固酶试验， 此为检出葡萄球菌， 如阳性一般为金黄色葡萄球菌； 如阴性应做试管 法凝固酶实验确证， 玻片法仅为筛选实验。 血浆凝固酶实验用血浆须 用兔或猪血浆， 新鲜血浆不稳定， 可能发生自我凝集或形成颗粒产生 浑浊或产生沉淀而导致判度错误； 不可使用人血浆， 其含有抑制物质 回干扰实验结果

42、。触酶阴性为链球菌科，根据菌落溶血进行下一步鉴定：a溶血：草绿色链球菌；肺炎链球菌；肠球菌B溶血：A A 群链球菌；B B 群链球菌，部分 D D 群链球菌 肠球菌也有不溶血菌落，不能根据溶血判断肠球菌。 链球菌主要实验： 胆汁七叶苷，七叶苷，菊糖，CAMCAM，P P 杆菌肽，高盐，奥朴托辛，胆盐 溶解。肠球菌为致病菌， 且肠球菌与非肠球菌耐药机制不同， 应进行鉴 别，肠球菌分为粪肠球菌和屎肠球菌； 非肠球菌分为牛链球菌和马链 球菌。肠球菌对青霉素耐药，非肠球菌对青霉素敏感。肠球菌的药敏 注意咼耐氨基糖甙的细菌，如咼耐氨基糖甙则意味氨基糖甙与B内酰胺类药物合用无协同作用。肺炎链球菌与草绿色链

43、球菌鉴别：肺炎链球菌奥朴托辛、菊糖、胆盐 溶解实验皆为阳性。但这 3 3 个实验都非特异，需联合应用方为最佳。 肺炎链球菌的青霉素药敏实验应注意，当青霉素（K-BK-B 法）的抑菌圈 直径大于或等于 19m19mm m寸为敏感，当小于 19mm19mm 寸不能确定是否中敏或 耐药，应做 MICMIC 稀释确证。2 2、革兰阴性杆菌 包括肠杆菌科、非发酵菌和弧菌科。第一步实验为氧化酶实验。氧化酶阴性为肠杆菌科；阳性为非发酵菌和弧菌科。 肠杆菌科包括大肠杆菌、变形杆菌、普罗菲登斯菌及摩根菌属、克雷 伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、耶尔森菌属。非发酵菌包 括铜绿假单孢菌、黄单孢菌、不动杆菌等。

44、氧化酶实验注意事项：需用铜绿假单孢菌做阳性对照。6060 秒内判读结果有效，而以 1010 秒内最佳。不要用含微量铁的取菌环或针，可用棉棒替代。革兰阴性杆菌的鉴定以 APIAPI 系列为国标，其他生化管仅为常规鉴定。标准化的微生物采集方法（一）基本原则1 1 、发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查，二、三级医院 微生物标本送检率不应低于 70%70%。2 2、 尽量在抗菌药物使用之前采集标本。3 3、 标本采集时应严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂 菌污染。4 4、 标本采集后应立即送至细菌室。床旁接种可提高病原菌检出率。5 5、 以棉拭子采集的标本如咽拭子、肛拭或伤口拭子，宜插

45、入运送培 养基送检。6 6、送检标本应注明来源和检验目的，使细菌室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境 （二）血液与骨髓的送检方法1 1、通常采血部位为肘静脉。疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股 动脉采血为宜，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本。2 2、采血部位的局部皮肤应严格消毒。 将采集的血液注入血培养瓶前， 应更换针头或过火消毒针头。3 3、每次采血量成人 5 510ml10ml，婴幼儿 1 12ml2ml,培养基与血液之比以 1010：1 1 为宜，以稀释血液中的抗生素。4 4、怀疑菌血症因尽早采血,体温上升阶段采血可提高阳性率,但要 防止因等待而延误时机。 对已用抗菌药物而不能停

46、药者, 可在下次用 药前采血。5 5、对疑为细菌性骨髓炎或伤寒病人,在病灶或髂前（后）上棘处严 格消毒后抽取骨髓 1ml1ml 作细菌培养。（三）尿液的送检方法1 1 、中段尿：女性采样前应先用肥皂水或 0.1%0.1%高锰酸钾溶液冲洗外阴 部及尿道口；男性须翻转包皮冲洗,用 0.1%0.1%新洁尔灭消毒尿道口, 灭菌纱布擦干后,收集标本。2 2、导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者,可用碘酒消毒尿道 口处的导尿管壁, 用联空针筒的细针斜穿管壁抽吸尿液；或拔去闭式 引流的集尿袋, 弃取导尿管前段尿液, 留无污染的膀胱内尿液数毫升 送检。不可从集尿袋的下端管口留取标本。3 3、送检标本以晨起第

47、一次尿为宜。4 4、室温下尿标本担搁稍久可导致尿内细菌浓度明显增加而影响病原 菌与污染菌的区分。不能立即送检者，可暂存 4 4C冰箱。（四） 痰标本的送检方法1 1、咳痰：清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于 无菌容器送检。痰量极少者可用 4545C1010 海化钠溶液雾化吸入导痰。2 2、 对咳嗽乏力或昏迷病人， 可用吸痰管经鼻腔或口抵达气管腔内 吸 引痰液。用纤维支气管镜可直接在病灶部位采集高浓度的感染病原 菌，但不能完全避免咽喉部正常菌群感染。3 3、 双侧肺部感染伴人工气道如气管切开或气管插管患者，可用吸痰 管经人工气道估插至叶支气管水平吸引痰液。4 4、 痰标本不能及时

48、送检者，可暂存 4 4C冰箱。室温下担搁数小时定 植于口咽部的非致病菌呈过度生长而肺炎链球菌、 葡萄球菌和流感嗜 血杆菌检出率明显降低（五） 手术创口、烧伤创面于脓液1 1、无菌生理盐水擦洗病灶表面后，用棉拭子采取病灶深部的脓液和 分秘物，置运送培养基内送检。2 2、对未溃疡的脓肿宜用碘酒、 酒精消毒皮肤后， 以无菌注射器抽取 脓液送检；也可于切开脓肿时用无菌棉拭子采样。3 3、采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。（六） 粪便的送检方法1 1、排便后，挑取有脓血、黏液部分的粪便 2 23g3g （液状粪便则取絮状物），盛于蜡纸袋内送检。2 2、对不易获取粪便者或婴幼儿，可用肛拭采集。将拭子

49、前端用无菌 甘油水湿润。然后插入肛门约 4 45cm5cm （幼儿约23cm3cm）处，轻轻旋 转擦取直肠表面黏液后退出，置运送普及内送检。（七）咽拭、口腔拭子的送检1 1、病人清水漱口后，由检查者将其舌外拉时悬幽垂尽可能向外牵 引，棉拭子越过舌根到咽后壁或悬幽垂的后侧，反复擦拭数次，插入 运送培养基。棉拭子应避免触及舌、口腔黏膜和唾液。对化脓性扁桃体炎或口腔念珠菌病，用棉拭 临床标本的处理1 1、血标本1.11.1 常见细菌 革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、溶血 性 链球菌、粪肠球菌、类白喉棒状杆菌、产单核李斯特菌等。革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、伤寒沙门菌

50、、流感嗜血 杆菌、大肠艾希菌、变形杆菌、产汽肠杆菌、铜绿假单孢菌、肺炎克 雷伯菌等。1.21.2 临床意义 血液培养应用于伤寒、 副伤寒、 化脓性细菌和其他革兰阴性杆菌引起 的败血症的诊断。目前引起败血症的细菌多为金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。 疥、痈和脓肿继发的败血症主要是金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌引 尿道、胆、胃肠黏膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌多见，其次为变 形杆菌、产汽肠杆菌、葡萄球菌。 急性细菌性心内膜炎以金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌、 脑膜炎奈瑟 菌常见；亚急性心内膜炎以草绿色链球菌多见，偶见肠球菌；化脓性 心包炎以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌多见。 血液病、肝硬化引

51、起的败血症金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌为主。 弥漫性血管内凝血以革兰阴性杆菌为主。 烧伤后败血症以铜绿假单孢菌为主。3 3、痰标本常见细菌： 肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、结核分 枝杆菌；脑膜炎奈瑟菌、 卡他布兰汉菌、 肺炎克雷伯菌、 大肠艾希菌、 铜绿假单孢菌、沙雷菌、流感嗜血杆菌。痰标本：须接种 2 2 个血平板, ,一个放普通孵箱，另一个放 COCO 孵箱. .痰标 本接种于血平板、麦康凯平板、巧克力平板。巧克力平板是用来筛选 流感嗜血杆菌。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检出率是衡量一个细菌 室水平的重要依据， 因此对于包括以上两种菌在内的苛养菌的鉴定应 引起重视。痰标本接种时，

52、第一区划完线后，接种环必须过火消毒， 否则将达不到分区的效果。痰标本建议接种 2 2 个血平板、一个巧克力平板、 一个麦康凯平板。 痰 标本于咽标本的处理基本相同。4 4、尿标本常见细菌：大肠艾希菌、葡萄球菌、变形杆菌 注意事项：尿标本不能离心，离心将使污染菌也集中于沉淀部分，导 致错误结果。一般而言，菌落大于105/ml105/ml 代表真正感染， 103/ml103/ml 以 下表示污染，104104105/ml105/ml 为怀疑污染，如病人的排尿速度太快或接 受药物治疗或尿的 pHpH 小于 5.05.0，比重小于 1.001.003 3时，细菌的数目可 能降低。因此病人若已服用抗生素

53、， 104/ml104/ml 菌落即需进行鉴定和抗 生素药敏试验。加强微生物实验室与临床科室的联系、密切合作，确保标本的质量： 微生物学检验的标本大多数都是由临床科室有关人员或患者 留取的，而留取的标本的质量是否符合要求就是一个非常重要的问 题，因此要与临床合作，确保标本的质量，主要有以下几个方面：1、血液（骨髓）标本的留取1）应在给患者使用抗菌药物之前留取标本。2）应在患者发热初起或发热高峰时留取。3）应尽量留取两次标本。4）留取标本时应尽量避免污染，如有可能污染时应注明。5）如考虑有厌氧菌感染时应同时作需氧菌及厌氧菌培养。6）如已给予患者抗菌药物治疗则应使用树脂培养瓶并在给药之前留取。7）儿童患者则应使用儿童培养瓶。8）如考虑有 L L 型菌感染的可能则应使用 L L 型培养瓶。2、下呼吸道分泌物标本的留取1）清晨留取。2）留取前用清水漱口三次。3）嘱患者用力咳出。4）如患者做纤维支气管镜检查则可同时抽取分泌物。5）昏迷患者可作气管穿刺吸取。3、 尿液标本的留取1）留取清晨第一次尿液。2）留取中段尿，女性患者则应清洗会阴部后留取中段尿。3）必要时可导尿留取标本。4）不应从留置导尿管