外来合物ZN2+对小鼠肝细胞SOD活力影响ppt课件

1、实验十实验十 外来化合物的毒性测定外来化合物的毒性测定 Zn2+Cu2+或或Cd2+ 对小鼠对小鼠肝细胞肝细胞SOD活力的影响活力的影响 由于工业废水的排放,重金属污染已成为主要的环境污染之一 。重金属进入食物链后就在高位营养级和低位营养级之间以吞食和被吞食的方式传送，并在生物体内富集。已有研讨阐明，锌、铜、镉毒性与氧化损伤亲密相关，能促进体内活性氧自在基的产生，使许多组织系统处于氧化应激形状。氧自在基可直接导致蛋白质、DNA及多糖类的构造和功能受损，也可经过使生物膜上的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化而损伤膜的构造。总之它们经过改动机体的抗氧化系统或膜脂质的过氧化来诱发不同组织的氧化性损伤。

2、在细胞内还存在着去除自在基的体系，主要有SOD,CAT, GSH-Px等。超氧化物歧化酶(SOD) 几乎存在于一切动物的细胞中,对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,此酶能去除超氧阴离子自在基(O-2 ) ,维护细胞免受损伤,是动物体内一种重要的抗氧化维护酶。 一、实验目的一、实验目的 本实验以小鼠为实验对象本实验以小鼠为实验对象,从锌铜或镉从锌铜或镉毒性的氧化损伤出发毒性的氧化损伤出发,测定染锌铜或镉测定染锌铜或镉后小鼠肝组织中超氧化物歧化酶后小鼠肝组织中超氧化物歧化酶SOD的活性变化的活性变化,以此讨论锌铜或镉对小鼠以此讨论锌铜或镉对小鼠肝脏抗氧化酶肝脏抗氧化酶SOD的影响的影响.

3、为细胞分子程度为细胞分子程度毒性机制讨论和环境平安性评价提供科学毒性机制讨论和环境平安性评价提供科学根据。根据。二、实验设计的根本原那么二、实验设计的根本原那么1 反复反复2 随机随机3 对照对照三、实验仪器、试剂与资料三、实验仪器、试剂与资料 1 实验仪器：冷冻高速离心机，分光光度计实验仪器：冷冻高速离心机，分光光度计,天平天平,恒温水浴锅。恒温水浴锅。 2 实验试剂：蛋白定量实验试剂：蛋白定量(双缩脲法双缩脲法)试剂盒，试剂盒，超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，预冷的试剂盒，预冷的0.9%生理盐水，冰醋酸，预冷的生理盐水，冰醋酸，预冷的0.25mol/L蔗糖蔗糖0.01mol/

4、LTris-盐酸缓冲液盐酸缓冲液pH7.4，5个不同的个不同的Zn2+Cu2+或或Cd2+浓度溶液浓度溶液400mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L ，25mg/L 。3 实验资料：九周龄昆白系小鼠实验资料：九周龄昆白系小鼠36只，雌雄只，雌雄各半。各半。四、实验步骤四、实验步骤1. 随机分组：九周龄昆白系小白鼠随机分组：九周龄昆白系小白鼠36只，雌只，雌雄各半。顺应豢养雄各半。顺应豢养2d后后,随机分成随机分成6组，每组，每组组6只，雌雄各半。只，雌雄各半。2. 染染Zn2+处置实验：设置处置实验：设置5个个Zn2+浓度梯度浓度梯度组组(400mg/L ，200mg/L，1

5、00mg/L，50mg/L，25mg/L)和一个阴性对照组双和一个阴性对照组双蒸水。各浓度梯度组皮下注射蒸水。各浓度梯度组皮下注射Zn2+ 溶溶液液0.5mL/小鼠小鼠, 阴性对照组皮下注射双蒸阴性对照组皮下注射双蒸水水0.5mL/小鼠。小鼠。3. 10%肝匀浆粗酶液的制备：皮下注射肝匀浆粗酶液的制备：皮下注射Zn2+ 溶液溶液24hr(48hr，72hr， 96hr后，颈椎后，颈椎脱臼处死后，以脱臼处死后，以70乙醇消毒外部后剖腹乙醇消毒外部后剖腹取肝，迅速用预冷的生理盐水洗净血水后，取肝，迅速用预冷的生理盐水洗净血水后，用干净滤纸吸干水分，然后称重并将肝剪用干净滤纸吸干水分，然后称重并将肝

6、剪碎，按每克肝加碎，按每克肝加9ml的冷匀浆介质的冷匀浆介质 0.25mol/L蔗糖蔗糖0.01mol/LTris-盐酸盐酸缓冲液缓冲液pH7.4到玻璃匀浆器中，在到玻璃匀浆器中，在冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆。在低温冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆。在低温离心机中离心机中3500r/min离离10min，上清液即，上清液即为为10%肝匀浆粗酶液，然后进展蛋白质含肝匀浆粗酶液，然后进展蛋白质含量的测定和量的测定和SOD活性的测定。活性的测定。4 蛋白质含量测定：蛋白质含量测定：蛋白质含量测定按下表进展操作：蛋白质含量测定按下表进展操作：空白管空白管标准管标准管测定管测定管蒸馏水蒸馏水/mL/mL0

7、.050.05蛋白标准液蛋白标准液/mL/mL0.050.055%5%肝匀浆肝匀浆/mL/mL0.050.05双缩脲试剂双缩脲试剂/mL/mL2.502.502.502.502.502.50混匀混匀,37,37水浴水浴10min10min，流水冷却后，于波长，流水冷却后，于波长540nm540nm，光径，光径1cm1cm，空白管调零，测定各管，空白管调零，测定各管ODOD值值蛋白质含量的计算公式：蛋白质含量的计算公式： 蛋白含量蛋白含量mg/ml = 测定管测定管OD/规范管规范管OD蛋白规范浓度蛋白规范浓度(61.5mg/ml)留意：留意：1 空白管与规范管均一个。空白管与规范管均一个。2检

8、测的蛋白质含量应在检测的蛋白质含量应在115mg/ml,假设高于此范围假设高于此范围,肝肝匀浆用匀浆介质作适当稀释。匀浆用匀浆介质作适当稀释。5 总总SOD活力测定：活力测定：总总SOD活力测定按下表进展活力测定按下表进展 ：试剂试剂测定管测定管对照管对照管SODSOD试剂一试剂一/mL/mL1.001.001.001.001%1%肝匀浆肝匀浆/mL/mL0.020.02蒸馏水蒸馏水/mL/mL0.020.02SODSOD试剂二试剂二/mL/mL0.100.100.100.10SODSOD试剂三试剂三/mL/mL0.100.100.100.10SODSOD试剂四试剂四/mL/mL0.100.1

9、00.100.10混匀混匀,37,37水浴水浴40min40min显色剂显色剂/mL/mL2.002.002.002.00混匀，室温放置混匀，室温放置10min10min，550nm550nm波长处，光经波长处，光经1cm1cm，以蒸馏水，以蒸馏水调零，测定各管调零，测定各管ODOD值值 总总SOD活力的计算公式：活力的计算公式： 总总SOD活力活力 = (对看管对看管OD-测定管测定管OD)/对看管对看管OD50%反反响液总体积响液总体积/取样量取样量ml组织蛋白含量组织蛋白含量(mg/ml) 留意最正确取样量的探求：留意最正确取样量的探求： 10%的肝匀浆，取样量分别为的肝匀浆，取样量分别

10、为10ul， 20ul， 30ul， 40ul， 50ul时，计算时，计算(对看管对看管OD-测定管测定管OD)/对看管对看管OD的的结果应该在结果应该在0.150.55之间，即百分抑制率在之间，即百分抑制率在15%55%之之间此段曲线根本呈直线关系，然后取百分抑制率在间此段曲线根本呈直线关系，然后取百分抑制率在48%50%的一管作为最正确取样量。的一管作为最正确取样量。 五、实验结果五、实验结果 将所测的将所测的SOD活力结果列于下表：活力结果列于下表：SODSOD活力活力ZnZn2+2+浓度浓度( (mg/L)阴性对照阴性对照2550100200400小鼠个体小鼠个体1小鼠个体小鼠个体2小鼠个体小鼠个体3小鼠个体小鼠个体4小鼠个体小鼠个体5小鼠个体小鼠个体6平均值平均值标准差标准差六、作业要求六、作业要求 本实验为综合设计性实验，为进一步训