超声波提取杠板归多糖的工艺研究

1、R917 贵州医科大学12届药学专业本科毕业论文超声波提取杠板归多糖的工艺研究 学 生： 黄韵蓓 学 号： 20120401107 年 级： 12 级 专 业： 药 学 指导教师： 王晓丽教授 实习单位：贵州医科大学生药学教研室2016年 4 月 7 日目 录 摘 要 1 前 言 2 材料与方法 2 结果与分析 5 讨 论 10 参考文献 12 致 谢 13超声波提取杠板归多糖的工艺研究学生：黄韵蓓 导师：王晓丽教授摘要：目的 从杠板归中提取多糖，并测定其含量计算收得率，为杠板归质量控制和资源开发提供科学根据。方法 在单因素考察提取杠板归多糖的基础上，采用正交试验设计法；以杠板归药材多糖含量为

2、指标，用超声波辅助提取，醇沉法得到多糖沉淀，用高浓度醇清洗沉淀，加蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在490nm处测定吸光度，以葡萄糖标准品为对照品，计算杠板归多糖的提取率，确定最佳提取工艺。结果 研究3个较显著因素，液料比、提取温度、提取时间对杠板归多糖提取率的影响；在此基础上，用正交试验法确定了杠板归多糖最佳提取工艺为：料液比1:10，提取温度80，提取时间30min，最高提取率为3.34%。结论 优化的提取工艺提取多糖效果好，稳定可行，对杠板归多糖的进一步研究和杠板归药材的质量评价具有科学的参考价值。关键词：超声波；多糖；工艺优化Ultrasonic extraction bar plate t

3、echnology research of polysaccharidesAbstract：Purpose To extract polysaccharide from poles board, and the determination of its content rate calculation, bar plate to provide a scientific basis for quality control, and resource development.Method Polysaccharide extraction bar plate to the single fact

4、or investigation, on the basis of orthogonal experiment design method; Herbs polysaccharides content as an index, with bar plate by ultrasonic assisted extraction, alcohol heavy precipitation method for polysaccharide, clean with high concentration of alcohol precipitation, add distilled water to di

5、ssolve, using the phenol - sulfuric acid method determination of absorbance at 490 nm, with glucose standard as reference substance, extraction yield of polysaccharide in bar plate to determine the optimal extraction process.Result Research three significant factors, liquid ratio, extraction tempera

6、ture and extraction time on the bar plate to the influence of the polysaccharide extraction yield; On this basis, the poles are determined by using orthogonal test plate for polysaccharide extraction process is: the best material liquid than 1:10, extraction temperature 80 , extracting time 30 min,

7、the highest ratio of 3.34% .Conclusion To optimize the extraction technology to extract polysaccharide effect is good, stable work, the experiment of bar plate polysaccharide and poles for the further study of the board for the quality of medicinal materials evaluation provides a reliable experiment

8、al basis.Key Words：ultrasonic；polysaccharide；Process optimization1.前言 杠板归为蓼科蓼属植物杠板归Poly gonum perfoliatum L.的干燥地上部分，又名蛇倒退，穿叶蓼等。原收载于贵州省中药材、民族药材质量标准“1”，现为中国药典2010版新增品种。目前，药典2015版“2”并未规定杠板归多糖的含量测定，本文对杠板归多糖的提取方法进行工艺优化，通过计算多糖收得率选出最优提取工艺，有利于杠板归药材资源的保护和开发利用。 据中药大辞典记载，杠板归全草入药，具备清热解毒、杀虫止痒、祛风止咳、利水消肿的功效，民间普遍用于

9、治疗水肿尿少，咽喉肿痛，疟疾，痢疾，小儿顿咳，溃疡，湿疹，疱疹，疥廯及蛇虫咬伤等，疗效显著“3-4”。该植物含有丰富的生物活性物质，主要有黄酮、酚类、生物碱、有机酸、糖类等“5-6”。多糖是由多个单糖基及糖苷键相连而成的高聚物，一般是10个单糖通过苷键方式连接而成，广泛存在于动物细胞膜、高等植物和微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，同维持生命活动密切相关“7-8”，多糖近年来被发现能有效清除人体内的氧自由基，极高机体的免疫功能，并具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗溃疡等多种生物功能，且无毒副作用，可广泛应用于医疗保健、食品等领域，作为绿色生物医药产品，具有广阔的市场前景“9-10”。杠

10、板归为中国药典2010版新增品种，在我省资源非常丰富，若能够全面开发利用，前景非常可观。目前关于杠板归多糖的研究甚少，本文首次采用超声波辅助法提取杠板归多糖，并采用正交实验研究出最佳提取工艺，为杠板归资源的开发与利用提供实验和理论依据。2.材料与方法： 2.1材料:杠板归采于贵州省黔东南州榕江县，经贵州医科大学药学院生药教研室王晓丽教授鉴定为杠板归（Poly gonum perfoliatum L.），除杂切断，于60干燥箱中烘干，粉碎（过四号筛），放于干燥器中备用。 主要试剂: 98%硫酸（重庆川东化工（集团）有限公司）、苯酚（国药集团化学试剂有限公司）、95%乙醇（重庆川东化工（集团）有限

11、公司），均为分析纯，水为蒸馏水，D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号110833-201205）。 主要仪器与设备：TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造)，UV-5800PC型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），BS223S电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司,101-1-S电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），AS系列超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），FW135中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。 2.2试验方法 2.2.1供试品溶液的制备：精密称取杠板归粉末1g于50ml具塞锥形瓶中，按一定料液比加入蒸馏水，在120W超声波清洗仪中超声

12、提取，然后用循环水式多用真空泵进行抽滤得滤液，取滤液1ml加 95%的乙醇溶液 2 ml，放置24 h，将样品溶液放入高速离心机中，转速为3600 r·min1，离心10 min，弃清液，用95% 的乙醇清洗沉淀，取沉淀于10ml容量瓶中加入适当蒸馏水溶解并定容“11”。 2.2.2对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的D-葡萄糖对照品5mg，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，摇匀，制成浓度为0.5mg/ml葡萄糖标准液。 2.2.3显色剂的配制：精密称取分析纯苯酚80g加蒸馏水20g使之溶解，摇匀置棕色瓶中，放置4冰箱长期储存，备用。临用前用80%苯酚溶液加蒸馏水稀释成5%

13、苯酚溶液，用于实验。 2.2.4测定波长的确定：精密量取葡萄糖标准溶液1ml于10ml具塞试管中，加入1ml5%苯酚溶液，摇匀，加入5ml98%硫酸溶液，摇匀后常温静置10min，后40ºC水浴15min，取出后静置至室温“12”，在190600nm波长范围内用紫外分光光度计全波长扫描，选择最大吸收波长作为杠板归多糖的吸收波长进行测定。 2.2.5标准曲线的绘制：分别精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml对照品溶液于6只10ml具塞试管中，加蒸馏水至2ml，加入1ml5%苯酚溶液，摇匀，加入5ml98%硫酸溶液，摇匀后常温静置10min，后40ºC水浴1

14、5min，取出后静置至室温，在波长490nm处测定吸光度。精密量取蒸馏水2ml同上述操作作空白，然后在波长490 nm处测定吸光度，以吸光度 (A) 为横坐标，葡萄糖浓度（C）为纵坐标，得标准曲线方程。 2.2.6精密度试验：精密量取同一葡萄糖对照品溶液，按照“2.2.3”项方法测定吸光度，重复测定5次，根据标准曲线方程得到葡萄糖的含量，计算RSD值。 2.2.7重复性试验：取同一杠板归样品，按照“2.2.1”项方法制备供试液5份，按照“2.2.5”项方法测定吸光度，计算RSD值。 2.2.8稳定性试验：取同一供试液，分别于0，2，4，6，8，12，24h按照“2.2.5”项方法测定吸光度，计

15、算RSD值。 2.2.9加样回收率试验：精密量取适量供试液5份，分别加入不同量对照品溶液，按照“2.2.3”项方法依法测定吸光度，计算平均回收率和RSD值。 2.2.10测定法：称取药材适量按照供试品方法制备，分别量取1ml供试品溶液于10ml具塞试管，加入1ml5%苯酚溶液，摇匀，加入5ml98%硫酸溶液，摇匀后常温静置10min，后40ºC水浴15min，取出后静置至室温，在波长490nm处测定吸光度。 2.2.11杠板归多糖得率的计算： 精密量取供试液1ml按“2.2.5”项测定吸光度，通过标准曲线方程计算供试液浓度，根据下列公式计算多糖得率。 多糖得率（%）=C ×

16、 V × D/W × 100% 其中：C为被测液浓度（mg/ml），D为稀释倍数；V为总体积（ml）；W为原料质量（mg）。 2.3单因素实验设计 2.3.1料液比对多糖提取率的影响：精密称取1g杠板归粉末5份，分别设置料液比为1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，在70，超声功率为120W的超声波清洗仪中超声20min，按“2.2.1”项所述方法抽滤，离心，清洗沉淀，将沉淀稀释至10ml得样液，取1ml按照“2.2.9”项测定杠板归多糖含量，计算提取率，研究不同的料液比对多糖提取率的影响。 2.3.2提取时间对多糖提取率的影响：精密称取1g杠板归粉末5份，放入

17、锥形瓶中，按照1:20的料液比加入蒸馏水，分别设定超声时间为10min、15min、20min、25min、30min，在70，超声功率为120W的超声波清洗仪中超声提取，按“2.2.1”项所述方法抽滤，离心，清洗沉淀，将沉淀稀释至10ml得样液，取1ml按照“2.2.9”项测定杠板归多糖含量，研究不同的提取时间对多糖提取率的影响。 2.3.3提取温度对多糖提取率的影响：精密称取1g杠板归粉末5份，放入锥形瓶中，按照1:20得料液比加入蒸馏水配制溶液，分别设定提取温度为60、65、70、75、80，在120W的超声波清洗仪中超声20min，按“2.2.1”项所述方法抽滤，离心，清洗沉淀，将沉淀

18、稀释至10ml得样液，取1ml按照“2.2.9”项测定杠板归多糖含量，计算提取率，研究不同的提取温度对多糖提取率的影响。 2.3.4超声强化提取杠板归多糖的正交实验设计本实验以杠板归多糖得率为主要指标，选取料液比（A），提取时间（B），提取温度（C）3个影响因素，各自设定5水平进行正交实验，因素水平表见表1。表1 正交试验设计因素表水平提 取 因 素料液比A提取时间B/min提取温度/11:10106021:15156531:20207041:25257551:303080 2.3.5 数据处理：独立重复进行3次实验，结果表示3次测定的平均值。3. 结果与分析 3.1试验测定结果的分析 3.1

19、.1测定波长选择：由图1可知，在190600nm波长范围内用紫外分光光度计全波长扫描，测定最大吸收波长为490nm，见图1。图1 标准品紫外分光光度波谱图图2 样品紫外分光光度波谱图 3.1.2线性关系考察：以浓度C对吸光度A作线形图，得葡萄糖溶液标准曲线回归方程y=0.5407x+0.0288（R2=0.9912)，如图3所示.结果表明，葡萄糖标准溶液经硫酸-苯酚法显色后在0.05mg/ml0.3mg/ml范围线性关系良好。图3 葡萄糖标准曲线 3.1.3精密度试验：精密量取对照品溶液1ml，置于10ml具塞试管中，按照“2.2.4”项方法，连续进行5次测定吸光度值，计算RSD=0.047，

20、该结果表明仪器的精密度良好。 3.1.4重复性试验：精密称取杠板归粉末1g，共5份，按照“2.2.1”项方法制备供试液，再按照“2.2.10”项方法测定吸光度值，计算RSD=0.071，结果表明该方法的重复性良好。 3.1.5稳定性试验：精密称取杠板归粉末1g，按照“2.2.1”项方法制备供试液，于0,2,4,6,8,12,24h按照“2.2.10”项方法测定吸光度，计算RSD值=0.11，表明供试品溶液在24h内稳定。 3.1.6加样回收率试验：精密称取杠板归粉末1g，按照“2.2.1”项方法制备供试液，精密量取0.25ml供试液5份，分别加入不同量对照品溶液，用蒸馏水稀释至2ml,按照“2

21、.2.10”项方法测定吸光度值，求得平均回收率=99.3%，RSD=1.02,结果表明该方法回收率良好，所制定分析方法的准确度高。 3.2料液比的影响 由图4可知，杠板归多糖的提取率随着料液比的增加而逐渐减小，当料液比超过1:15时，提取率的下降趋势趋于平缓。这主要是因为随着水的加入量增多，超过一定比例后，则促进杠板归多糖的水解作用，使得杠板归多糖的提取率急剧下降，促进提取的作用也不再明显，从而使整体提取率趋于稳定。但由于于超声提取的杠板归为干燥粉末，料液比过小也不利于杠板归粉末与溶液充分接触，提取溶液过少极易损失，从而使提取误差增大。因此，料液比控制在1:10为宜。图4 料液比对多糖得率的影

22、响 3.3提取温度的影响 由图 5可知，升温有利于提高多糖得率，随着提取温度的提高，杠板归多糖的提取率不断提高 ,在温度达到70时达到最大，随后随着温度的升高提取率缓慢下降。因此可以看出杠板归多糖在溶剂中具有一定的溶解度，多糖易溶于热水，温度过小，提取不完全；而提取温度过高，可能会破坏多糖的糖苷键，使多糖发生降解而影响其生物活性；也可能由于过高的温度下，性质遭到破坏的多糖，经苯酚浓硫酸作用不易被检测，因此导致多糖的提取率降低，故提取温度控制在70为宜。图5 提取温度对多糖得率的影响 3.4提取时间的影响 由图6可知，提取时间越长越有利于杠板归多糖的提取，但当提取时间超过15min以后，多糖提取

23、率趋于稳定，基本保持同一水平。提取时间15min30min的提取率基本一致，考虑到提取时间过长会延长生产周期，在保证提取效果的同时尽量节省时间，因此提取时间控制在15min为宜。图6 提取时间对多糖得率的影响 3.5多因素的影响由于提取率实际上是受料液比、提取时间、提取温度三个因素交叉影响，为了全面考察这三个因素的影响，设计了三因素五水平正交试验对杠板归多糖的提取工艺进行优化，并通过正交试验结果以确定各因素对提取率的影响程度，结果详见表2。对表实验数据结果进行极差R分析可知，料液比A对多糖提取率的影响最大，其次是提取时间B，提取温度C影响相对较小。因此，各因素对多糖提取率的影响大小为：料液比&

24、gt;提取时间>提取温度。根据上述结果确定提取杠板归多糖的最佳参数为：料液比1:10，超声时间30min,超声温度80。在此条件下，杠板归多糖的提取率为3.34%。表2 正交试验结果实验号ABC吸光度A得率%11110.4942.9421220.4372.6531330.3762.3241440.4322.6251550.5663.3462120.2441.6072230.3492.1782340.3322.0792450.3121.97102510.2771.78113130.2341.53123240.2631.70133350.2481.63143410.2621.70153520

25、.2631.70164150.1851.28174210.1771.24184320.1941.33194430.2211.48204540.2011.37215150.1581.14225210.1601.15235320.1691.20245430.1871.29255540.1671.19K12.771.701.78K21.921.781.73K31.651.711.74K41.341.811.77K51.191.881.86R1.580.180.134. 讨论 植物都有细胞壁，多糖的提取需要依靠渗透压的作用压的作用从组织细胞内穿过细胞膜和细胞壁才能溶解释放出来，而传统的处理方法却难以达

26、到破碎细胞破壁的程度，多糖的分子量又都比较大，故提取效果不佳，造成资源利用率低、提取时间长、能耗高、有效成分损失严重。 水提醇沉法是目前较为常见的多糖提取方法，利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖，其试验设备简单，工艺成本低、操作容易，准确度高，适于大规模的工业生产，是一种可取的多糖提取方法“14”。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法是常用的多糖含量测定方法。研究表明，苯酚-硫酸法方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响较稳定，是较理想的多糖含量测定方法；而蒽酮-硫酸法稳定性较差，线性关系不理想，重复性、稳定性所测数据差异较大“15”。因此，本实验中采用苯酚-硫酸法测定杠

27、板归药材的多糖含量。本实验首次采用超声波浸提法，提取杠板归药材中的多糖，设计了三个提取因素（本来是设计了四个提取因素：包括料液比、提取时间、提取功率和提取温度，但由于实验室条件限制，只能舍去提取功率这一因素），并采用正交实验的出最佳提取工艺，实验结果表明提取率高，结果证实可靠，所受外界因素干扰少；所用方法快速简便、高效低能、灵敏度高、不需要精密仪器；用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量，使测得多糖含量不受蛋白质影响，结果更加精确。所用到试剂少且安全、低毒、价格低廉。提取效果好，正交实验的出最佳提取工艺为料液比1:10，超声时间30min,超声温度80。在此条件下，杠板归多糖的提取率为3.34%，比水浸

28、提法高出两倍，实验数据准确可靠，可为杠板归多糖的定量分析及质量评价控制提供了科学依据。多糖是杠板归药材重要活性成分之一，具有多方面的生物功能和良好的临床效果，本实验研究了提取杠板归多糖的最佳工艺，多糖含量可作为杠板归药材质量评级的指标之一。现在还没有关于超声波提取杠板归多糖工艺优化的文献，因此，研究优化杠板归多糖的提取条件有重要意义，可为杠板归药材的质量控制与评价提供实验依据。 参考文献1贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准S.贵阳：贵州科技出版社，2003:198.2国家药典委员会.中国药典（2015年版）M.北京：中国医药科技出版社，2015.3瞿自明，徐方舟，兽医中草药大全M.北京：中国农业科技出版社，1996:396.4江苏新医学院.中药大辞典（上册）M.上海：上海科技技术出版社，2000:869-871.5 赵超，陈华国，龚小见，等，杠板归的化学成分研究（）J.中草药，2010,41（3）:365-367，6李红芳，赵有兴，刘玉清