基因工程的基本操作程序导学案

1、基因工程的根本操作程序(共2课时)【学习目标】1、简述基因工程原理及根本操作程序.2、尝试设计某一转基因生物的研制过程.【学习重点】 基因工程根本操作程序的四个步骤.【学习难点】(1)从基因文库中获取目的基因.( 2)利用PCR技术扩增目的基因.自主研习(理知识,固根底)一、目的基因的获取：1、目的基因：符合人们需要的,编码蛋白质的.2.获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多,导人受体菌的群体中,各个受体菌分别 含有这种生物的不同基因,称为基因文库.基因组文库：含有一种生物的基因种类-J- cDNA文库：含有一种生物的基因目的基因的获取根据基因

2、的有关信息：基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNA基因的产物蛋白质等特性获取目的基因.(2)利用PCFa术扩增目的基因.PCR:是一项在生物体外特定 DNA片段的核酸合成技术. 条件：目的基因的序列. 过程：目的基因 DN砥热形成,与结合,然后在 的作用下进行延伸形成 DNA方式：指数扩增=2n (n为扩增循环的次数)(3)人工合成法：基因较小,核甘酸序列,可以人工合成.二、基因表达载体的构建1、表达载体的组成：目的基因 +标记基因等.2、启动子：位于基因的,它是结合的部位,驱动基因转录产生mRNA3、终止子：位于基因的,终止.4、表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且给

3、下一代；使目的基因_和发挥作用.5、标记基因：受体细胞是否含有目的基因.6、不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同,基因表达载体的构建上也会有所差异.、将目的基因导入受体细胞(一)转化：目的基因进人受体细胞内,并在受体细胞内维持稳定和的过程.(二)方法1、将目的基因导入植物细胞(1)农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染植物和裸子植物,对 植物没有感染力；Ti质粒的可 转移至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体上. 转化：目的基因插人进入 农杆菌一导入植物细胞一目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达.(2)基因枪法基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法,但

4、是本钱较高.(3)花粉管通道法花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法,是一种十分简便经济的方法.(我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的)2 .将目的基因导入动物细胞(1)方法：注射技术.(2)操作程序：目的基因表达载体一取卵(受精卵)一显微注射一注射了目的基因的受精卵移植到 性动物的 内发育一新性状动物.3 .将目的基因导人微生物细胞(1)原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等.(2)转化：处理细胞一细胞一表达载体与感受态细胞混合细胞吸收DN酚子.四、目的基因的检测与鉴定1 .检测(1)方法：标记了的、抗原抗体杂交.(2)内容检测转基因生物染色体的 DNA否插入. 检测目的

5、基因是否转录. 检测目的基因是否译成.2 .鉴定：鉴定、抗病鉴定等.DNA重组 转基因技术 DNA分子 DNA重组技术限制性核酸内切酶限制酶黏性末端平末端双链DNA片段互补的黏性末端之间T4 噬菌体 黏性末端平末端 平末端质粒 自我入噬菌体的衍生物 动植物病毒结构基因DNA片段 储存所有局部核甘酸 染色体转录 译复制核甘酸 单链 引物DNA聚合酶 启动子 终止子 首端RNA聚合酶识别尾端 转录 可以遗传能够表达鉴别 表达 双子叶大多数单子叶2+T-DNA Ti质粒的T-DNA上 显微 提纯 雌 输卵管或子宫 C a 感受态(在一定的温度下促进)感受态“探针与基因组 DNA杂交 是否插入了目的基

6、因是否转录出了 mRNA蛋白质 抗虫鉴定抗虫、抗病鉴定属于个体生物学水平鉴定互动探究释迷惑,升水平基因工程图解：抗虫棉的培育过程苏云金浮胞 杆菌HiitE最白、 转入 因衣杵演1VDN ATi底粒构建总囚 茂达越休抗虫种胃1巴!目的壮阳捕人到染/色体DNA中棉株外II胞探究一目的基因的获取问题1:什么是目的基因目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因,如抗虫基因,抗旱基因.问题2:获取目的基因的途径有哪些 获取目的基因的常用方法有哪些获取方式途径：从已有物种中别离和人工合成获取目的基因的常用方法：.从基因文库中获取目的基因 未知序列.利用PCR技术扩增目的基因序列.用化学方法直接人工合成基因比拟小

7、,序列1.基因文库构建方法直接别离法某种生物的全部DNA限制酶反转录一定大小的DNA片段与载体连接gA聚合酶导入受体菌中储存基因组文小导入受体菌中储存反转录法某种生物某时期的 mRNA4单链互加DNAT双链cDNA片段与?体连接cDNA文库基因文库中不是直接保管相应基因,而是保存受体菌,菌中含基因2.PCR技术原理：DNA复制前提：一段目的基因的核甘酸序列,以便根据这一序列合成引物条件：模板DNA需含有目的基因 卜四种脱氧核甘酸dNTP、热稳定DNA聚合酶Taq酶、一对引物、温度限制过程：a、DNA变性90C-95C:双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链 DNAb、退火复性55C-65

8、 C:系统温度降低,引物与 DNA模板结合,形成局部双链c、延伸70C-75C:在Taq酶的作用下,合成与模板互补的DNA链.d.重复a.b.c步骤：每重复一次,目的基因增加一倍结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增3.PCR扩增技术与 DNA复制的比拟PCR技术DNA复制相原理DNA复制碱基互补配对同原料四种游离的脱氧核甘酸点条件模板、ATP、酶、原料、引物不解旋方式DNA在图温卜受性解旋解旋酶催化同场所体外复制PCR扩增仪主要在细胞核内点酶热稳定的DNA聚合酶Taq酶细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的 DNA片段形成整个DNA分子4.人工合成.反转录法：以目的基因转录

9、成的信使 RNA为模板,反转录成互补的单链DNA cDNA,然后在酶的作用下合成双链 DNA ,从而获取所需的基因.根据的氨基酸序列合成 DNA法：根据蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后根据碱基互补配对原那么,推测出它的结构基因的核甘酸序列,再通过化学方法,以单核甘酸为原料合成目的基因.探究二基因表达载体的构建 问题1:为什么要构建基因表达载体单独的 DNA片段能不能稳定遗传 构建表达载体的目的：1使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；2使目的基因能够表达和发挥作用.问题2:基因表达载体的构成包括哪些元件绘制基因表达载体的模式图基因表达载体的组成：复制原点+目的基

10、因+启动子+终止子+标记基因模式图：问题3:什么是启动子、终止子各有什么作用启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出 mRNA ,最终获得蛋白质 终止子位于基因尾端的一段特殊的DNA片断,能终止 mRNA的转录.问题4:基因工程的运载体是否必须要有标记基因一定需要！是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来.注意!标记基因的作用不是目的基因的检测和鉴定,而是鉴别和筛选含有目的基因的细胞.问题5:怎样才构建基因表达载体 填空用一定的 限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出 黏性末端.用 同一种限制酶 切断目

11、的基因,使其产生 相同的黏性末端.将切下的目的基因片段插入质粒的 切口处,再参加适量 DNA连接酶,形 成了一个重组 DNA分子重组质粒瓯粒工DN*处于同理跟TV. J-1 U ITT. BDtAii接梅L lI附图载体质粒DIMA分子含目的域因同-种限制牌切割-带有翱性带有相同新性末末端切口端的月的其因片段I .1DNA连接触用粗DNA跖状前纲质粒目的基因与运载体的结合过程,实际上是不同来源的基因重组的过程探究三 目的基因导入受体细胞-转化问题1:什么是转化目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程.问题2:比拟将目的基因导入受体细胞方法?细胞类型常用方法受体细胞转化过程植

12、物细胞农杆菌转化法体细胞、受精卵将目的基因插入 Ti质粒的T-DNA上一转入农杆菌一导入植物细胞一整合到受体细胞的DNA上一表达动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯一 取卵爻精卵一显被注射一早 期胚胎培养一胚胎移植一发育成为具后新性状的动物微生物Ca2+处理增大细胞壁通透性原核细胞细胞 或酵母菌用Ca2+处理细胞一感受态细胞一重组 表达载体DNA分子与感受态细胞混合 一感受态细胞吸收 DNA分子探究四 步骤四：目的基因的检测与鉴定一一检查是否成功问题1:受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗 不能,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达.问题2.

13、目的基因的检测内容和方法的比拟步骤检测内容方法结果小分子检测第一目的基因是否进 入受体细胞DNA分子杂交DNA 和 DNA之间是否成功显示出 杂交带第二步目的基因是否转WB mRNA分子杂交技术DNA 和mRNA之间是否成功显示出 杂交带第三步目的基因是否翻 译出蛋白质抗原一抗体杂交是否成功显示出 杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比拟,以确定功能是否相同等.问题3,试分析真核生物的基因导入细菌细胞后,不能正常发挥成效的可能原因有哪些? 被细菌体内的限制性内切酶破坏.该基因指导合成的蛋白质不能在细菌体内正确修饰和表达.细菌的

14、RNA聚合酶不能识别真核基因的位点,致使不能启动转录.细菌细胞中没有切除内含子转录局部的酶.问题4.3 -珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分.当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症.假设让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的3-珠蛋白,想一想,应如何进行设计(1)从小鼠中克隆出3 -珠蛋白基因的编码序列(cDNQ.(2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因,构建成一 个表达载体.(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠 杆菌.如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培

15、 养基上长出大肠杆菌菌落,那么说明3 -珠蛋白基因已进入其中.(4)培养进入了 3 -珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取3-珠蛋白.拓展延伸分子杂交技术DNA分子杂交技术又称 DNA探针技术,是利用 DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对 的高度精确性,对某一特异性 DNA序列进行探查的新技术.基因探针基因探针,即核酸探针,是一段带有检测标记,且顺序的,与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA1基因探针通过分子杂交与目的基因结合,产生杂交信号,能从浩翰的基因组 中把目的基因显示出来.根据杂交原理,作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件： 应是单链,假设为双链,必须先行变性处理.

16、应带有容易被检测的标记.它可以包括整个 基因,也可以仅仅是基因的一局部；可以是DNA身,也可以是由之转录而来的RNA附：目的基因的检测和表达提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA ,然后高温解成单链,再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体, 并提取出而来的.反应平台勤练习,学方法1、基因工程的操作步骤：制备重组DNA子转化受体细胞筛选出获得目的基因的受体细胞,培养受体细胞并诱导目的基因的表达获取目的基因正确的操作顺序是C A.B .C .D .2、以下获取目的基因的方法中需要模板链的是D 从基因文库中获取目的基因

17、 利用PCR技术扩增目的基因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A、B、 C、D、D从基因组文库中提取3、以下属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成从受体细胞中提取利用DNA转录利用PCR技术人工合成A.B.C.D.D4、有关基因工程的表达正确的选项是D A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5、以下关于限制酶的说法正确的选项是B A、限制酶广泛存在于各种生物中,但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核甘酸序列C、不同的限制酶切割 DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定

18、核甘酸形成的氢键6、某种限制酶在一线性 DNA分子上有3个酶切位点,如图中箭头所指.如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断,那么会产生a、b、c、d四种不同长度的 DNA片段.现有多个上述线性 DNA分子,假设在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断, 那么从理论上讲,经该酶切割后,这些线性DNA分子最多能产生长度不同的 DNA片段种类数 是C 援性口 “八分子的酶切示意国A、 3 B、 4C、9 D、127、基因工程是在 DNA分子水平上进行设计施工的.在基因操作的根本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是CA、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达8、以下关于基因工程的表达,错误的选项是DA .目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B.限制性核酸内切酶和 DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛