脾脏单个核细胞的制备

1、脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将 5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置 200目无菌尼龙网上, 分次滴入4 5 ml RPMI1640 培养液 , 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) ,1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心 5 min, 弃上清 ; 加入 2 ml pH7. 4 的 PBS, 混匀后 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心 5min, 弃上清 ; 加入 4 ml RPMI1640 培养液，混匀，用RPMI1640培养液稀释2

2、00倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数,根据计数结果用RPMI1640将细胞悬液调成2 X 10 / 300 m 的浓度。流式细胞术检测小鼠 脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置 70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3 次。加入2 mL RPM I- 1640 完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后 , 用毛玻片轻柔研磨组织碎片 , 经 8 层纱布过滤制成单细胞悬液, 经 H anks 液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。

3、台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5X 10 cells /L 。粗江篱多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用 7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用 R PMI-1640 培养液漂洗。粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬 , 用 300 目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。收集滤过的细胞悬液, 加人 0.83 % 的

4、氯化铵到滤过的细胞中, 静置 5 min , 以除去血红细胞。用RPM-ll640 培养液离心( 2500r/min,10min) 洗涤细胞3 次 , 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培养瓶中 , 在 37 、 5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养。台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。从Ca2+1路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制14 日龄健康鸡，无菌取脾脏，Hanks' 液洗 3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心( 1000r/min) ，弃上清，

5、Tris-NH4Cl 破解红细胞，冰水浴放置10min,离心(1000 r /min) ,弃上清，Hanks'液洗3次。加入无酚红 1640培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1 X 10 cell /mL 。于96孔细胞培养板培养。马尾藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察61. 3 鼠脾淋巴细胞的制备小鼠脱颈处死, 于 75%酒精中浸泡5 min, 在超净工作台中无菌打开腹腔, 取出脾脏, 用含有高浓度青链霉素（ 青霉素 300 IU/ ml+ 链霉素300 w g/ ml）的PBS液洗涤2-3次，剥去脾脏周围结缔组织。将处理好的脾脏移入一无菌青霉素瓶中, 加入适量的R

6、PMI1640 完全培养液（ RPMI1640+ 10%胎牛血清+ 青霉素 100IU/ml+ 链霉素100 g /ml）, 眼科剪剪碎,400目网筛过滤，收集滤液并叠加于等体积的小鼠淋巴细胞分离液上, 2000 rpm 离心 15 min 。用无菌吸管取灰白层, 加入适量RPMI1640 完全培养液后, 1 000 rpm 离心 5 min 、去上清液, 用适量 RPMI 1640 完全培养液重悬细胞, 取微量重悬细胞液, 加等体6 积 0.4%台盼蓝染色液, 染色 2 min, 计数活细胞后, 用 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 X10 /ml（ 细胞活率95%以上） ,

7、备用。苯对母鼠和子鼠脾淋巴细胞的增殖与凋亡影响2. 3. 2 脾淋巴细胞增殖功能检测。处死小鼠后, 各取脾脏8 个 , 轻轻研磨成匀浆200 目筛网过滤, 制备脾细胞悬液, 离心 , 1500 rm10m in, 弃上清 , 加入适量红细胞裂解液 （ 1m l 悬液中加3m l）, 螺旋震荡3m in,6PBS 洗2次，含10%9台牛血清的RPMI- 1640培养液重悬，调整细胞密度为2X10 /ml 加入 96 孔 U 型培养板中,每孔100 l。分别加入 ConA （ 10 g /m l） 100 l使其终浓度为 5 g /ml每个标 本3个复孔，5% CO2培养箱中培养 64h,培养结束

8、前4h加入MTT（ 5mg /ml） 20 以 培养 结束后离心1500 rm10m in, 小心吸去上清，力口入DMSO15（0l振荡10m in,酶标仪 550nm检测各孔吸光度（OD值）。复方阿胶浆对移植性肺癌小鼠脾、胸腺重量指数与脾淋 巴细胞增殖影响1. 2. 2 淋巴细胞悬液制备分离小鼠的派氏结（ Peyer S patches, PPs） , 肠系膜淋巴结 （ mesenteric lymph nodes, MLNs） , 脾脏 （ Spleen, SP） , 分别置于3 个盛有预冷PBS的无菌培养皿中，用研磨棒加适度力度轻轻研磨，于200目筛网过滤，收集细胞，制备单细胞悬液，以冷

9、PBS洗涤细胞两次（1 200 r/ min, 57 分钟），脾细胞以低渗法裂解红细胞，细胞计数，将细胞稀释到1X10cells/ ml 。茯苓多糖对免疫抑制小鼠粘膜淋巴组织及脾脏中 CD3+和CD19+细胞变化的影响1.4.3 小鼠脾淋巴细胞增殖的测定小鼠颈椎脱臼处死，无菌取出脾脏，置盛有适量无菌Hank' s液的小平皿中，用眼科剪轻轻将脾脏剪碎，经 200目筛网碾碎过滤，制成单细胞悬液，用Hank's 液洗 3 次，每次离心10 min （ 1 000 r/min ），去上清后加入预冷的 0.83%Tris-NH4Cl 裂解红细胞1 min ，再用 1640 培养液洗涤2-3 次，然后将细胞悬浮于2 mL完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为1.0 X 106个/mL。将细胞悬液分别加入96孔培养板中，每孔100 L,每组重复3孔（见表2）,各补加完全培养基至 200 L。置5%CO装养箱37 C培养72 h ,培养结束前 4 h ,弃去上清液, 加入100 L不含胎牛血清的 RPMI1640培养液，同时加入 MTT(5 mg/mL) 10 L/孔， 继续培养4