双缩脲法总蛋白测定

1、2013年秋季学期血清总蛋白测定血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）（双缩脲试剂法）南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心实验目的实验目的n 掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；n 掌握双缩脲试剂的配制；掌握双缩脲试剂的配制；n 熟悉血清总蛋白的临床意义；熟悉血清总蛋白的临床意义；n 了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。生物化学与分子生物学实验教学中心 总蛋白测定经典和常见的方法比较总蛋白测定经典和常见的方法比较方方 法

2、法灵敏度灵敏度 优优 点点缺缺 点点适用范围适用范围 凯氏定氮法凯氏定氮法0.20.21.0mg1.0mg氮氮准确性好、精密度高、准确性好、精密度高、灵敏度高。灵敏度高。操作复杂，费时操作复杂，费时用于标准蛋白质的用于标准蛋白质的定值、对其他方法定值、对其他方法校正等。校正等。 双缩脲法双缩脲法1 120mg20mg特异性高、准确度性好特异性高、准确度性好、精密度高、操作简单、精密度高、操作简单方便，显色稳定。方便，显色稳定。灵敏度低灵敏度低为临床测定血清总为临床测定血清总蛋白首选方法。蛋白首选方法。 Lowry Lowry法法（FolinFolin酚法）酚法）2020250ug250ug灵敏

3、度高、达双缩脲法灵敏度高、达双缩脲法的的100100倍。倍。干扰物质多、操作干扰物质多、操作要求严格计时要求严格计时适用于测定单一蛋适用于测定单一蛋白质及测定蛋白质白质及测定蛋白质含量较少的标本如含量较少的标本如脑脊液脑脊液紫紫 外外分光光度法分光光度法5050100mg100mg快速简便、无损样品快速简便、无损样品灵敏度低、干扰物灵敏度低、干扰物较多较多常用于较纯的酶和常用于较纯的酶和免疫球蛋白测定免疫球蛋白测定考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法（BradfordBradford）1 15ug5ug灵敏、简便、快速，干灵敏、简便、快速，干扰因素较少扰因素较少不同蛋白质与染料不同蛋白质与染料结合力不一致

4、，对结合力不一致，对比色杯有吸附作用比色杯有吸附作用常用于需求更高呈常用于需求更高呈色灵敏度的蛋白电色灵敏度的蛋白电泳泳化学比浊法化学比浊法简便、不需特殊仪器简便、不需特殊仪器影响浊度大小因素影响浊度大小因素多，如加试剂手法多，如加试剂手法、反应温度等、反应温度等一般用于测定尿液一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质、脑脊液等蛋白质含量较低的样品含量较低的样品生物化学与分子生物学实验教学中心原理原理-1-1n 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H H2 2N-OC-NH-CO-NHN-OC-NH-CO-NH2 2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与，因分

5、子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与CuCu2+2+发发生双缩脲反应生双缩脲反应 ，生成，生成紫红色络合物。紫红色络合物。生物化学与分子生物学实验教学中心原理原理-2-2n 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-CO-NH-），同样能在），同样能在碱性条件下与碱性条件下与CuCu2+2+发生双缩脲反应，生成的发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物紫红色络合物，且在且在540nm540nm处的吸光度与蛋白质的含量在处的吸光度与蛋白质的含量在1010120g/L120g/L范围内范围内有良好的线性关系。有良好的线性关系。 生物化学与分子生物学实验教学中心

6、实验材料实验材料n 样品：小牛血清样品：小牛血清n 试剂：试剂：6.0mol/LNaOH6.0mol/LNaOH溶液溶液 双缩脲试剂双缩脲试剂: :硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾 双缩脲空白试剂双缩脲空白试剂 蛋白质标准液（蛋白质标准液（70g/L70g/L） 蒸馏水蒸馏水n 器材：试管、烧杯、容量瓶、加样枪、刻度吸管、玻璃棒器材：试管、烧杯、容量瓶、加样枪、刻度吸管、玻璃棒n 设备：设备：11001100分光光度计、电子天平、水浴锅分光光度计、电子天平、水浴锅生物化学与分子生物学实验教学中心操作步骤操作步骤加入物（加入物（mlml） B (B (空白）空白） S S 标

7、准）标准） U U（待测）（待测）小牛血清（小牛血清（1 1：1010） - - 0.5 - - 0.5蛋白标准液（蛋白标准液（1 1：1010） - 0.5 - 0.5 -0.9%NaCl 0.5 - -0.9%NaCl 0.5 - -双缩脲试剂双缩脲试剂 4.0 4.0 4.04.0 4.0 4.0取3支试管，做好标记，按下表操作： 各管混匀，置3720min，在波长540nm处比色，以空白管调零，测各管吸光度。生物化学与分子生物学实验教学中心血清总蛋白测定数据处理表血清总蛋白测定数据处理表管号管号 测定次数测定次数 平均吸光度平均吸光度 1 2 3 1 2 3S SU U生物化学与分子生

8、物学实验教学中心计算计算）蛋白质标准液浓度（）血清总蛋白（g/LAAg/LSU生物化学与分子生物学实验教学中心参考范围参考范围n 正常成人正常成人606080g/L80g/Ln 长久卧床者约低长久卧床者约低3 35g/L5g/Ln 6060岁以上约低岁以上约低2g/L2g/Ln 新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1 1年后年后达成人水平。达成人水平。生物化学与分子生物学实验教学中心临床意义临床意义n 血清总蛋白浓度降低血清总蛋白浓度降低n 蛋白质合成障碍蛋白质合成障碍n 蛋白质丢失增加蛋白质丢失增加n 营养不良或消耗增加营养不良或消耗增加n 血浆稀释血浆稀释n 血清总蛋白浓度增高血清总蛋白浓度增高n 蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤n 血浆浓缩：脱水、休克血浆浓缩：脱水、休克生物化学与分子生物学实验教学中心思考题思考题n 1.1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中什么叫双缩脲试剂？为什么