第六章 RECOMBINATION_第1页
第六章 RECOMBINATION_第2页
第六章 RECOMBINATION_第3页
第六章 RECOMBINATION_第4页
第六章 RECOMBINATION_第5页
已阅读5页,还剩95页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、第六章遗传重组概述第一节 同源重组第二节 位点专一性重组第三节 转座重组第四节 真核生物中的转座成分第五节 异常重组概述: 只要有DNA,就会发生重组减数分裂高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座 生存变异突变,重组损伤修复、适应环境、加速进化 广义遗传重组:任何造成基因型变化的基因交流过程 重组可分为四类(DNA序列、蛋白质因子) 狭义遗传重组:涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 遗传重组与重组DNA技术异常 DNA重组引起进化 DNA重组引起DNA序列上的一些改变,可调节基因表达。 DNA重组可修复DNA损伤或复制障碍。 进行基因标记,检测突变基因位置和分离突变基

2、因。 掌握DNA重组机制为基因工程操作提供理论依据;同时,重组技术为研究基因重组开辟了新途径。DNA重组意义第一节 同源重组真核生物姊妹染色单体的交换;细菌及某些低等真核生物的转化;细菌的转导、接合。广泛存在于生物界.1、 同源重组(homologous recombination):发生在同源DNA序列之间一、特征2、 特征: 涉及同源序列间的联会配对,且交换的片段较大 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成 存在重组热点 需要重组酶 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 维持生物种群的多样性 染色体瞬间的物理连接,对染色体正确分离到子代细胞中至

3、关重要 用于损伤修复3、 同源重组的功能:1946年,Joshua Lederberg 和 Edward Tatum发现遗传信息可以在细菌之间转移a physical exchange of chromosome parts actually occursduring recombination在1961年,Matthew Meselson 和 J. J. Weigle 用实验证实两种不同遗传类型的噬菌体共感染E. coli,发现子代噬菌体中发生了交换。真核生物的同源重组发生在减数分裂时,姐妹染色单体间遗传物质间的交换;联会复合体将染色体排列在一起细菌的同源重组发生在接合过程中,交配的染色体在

4、两个紧密接触的细胞中转移。单细胞内在复制中和复制后的两条同源染色体也可发生交换。重组修复中也发生同源重组。断裂-复合中的概念 异源双链(heteroduplex):在重组部位,每个双链中均有一段DNA链来自另一个双链中的单链。这个部分称为异源双链(杂种DNA) 分支迁移:异源双链交叉连接中,交叉点沿着两条双链移动,称为分支迁移(branch migration)。 Holliday结构:两个DNA分子交叉重组时,在连接处则形成一个“四螺旋”作为中间物。这种结构称为Holliday结构(交叉结构)。双链侵入、单链侵入和双链断裂修复等均可形成Holliday结构二、同源重组的机制1、断裂复合(br

5、eakage and reunion)及Holliday中间体的形成同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链,在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为 Holliday结构形成的分子机制(断裂复合起始机制)有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种 同源重组都涉及到DNA分子内的断裂复合 Holliday结构 (Robin Holliday,1964 )(1)55其中所有模型和假说都包括切断、链置换、连接等过程双链侵入模型(2)3553Meselson-Radding模型单链入侵模型(链转移模型)置换侵入Loop切除同化 异构化 分支迁移5切割双链断裂(Double

6、 stranded breaks(DBS)修复模型2、分枝迁移和Holliday结构的拆分 分枝迁移(branch migaration)双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化异源双链heteroduplex DNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置(1)(2) Holliday结构的拆分(1)产生含异源双链的亲本DNA分子(2)产生重组体“亲本链”“重组体”The Holliday model for homologuous recomibination1、Holliday结构可发生立体或空间重排,使得

7、作为“桥”的链(即连接两条螺旋的交叉部分)转变为“外部”链,而原来的外部链则转变为“桥”链。2、最后由核酸酶将交叉处切断(解离resolution)而完成重组作用。这种异构转变可导致两条子链发生双重交换,或所有四条链发生单交换。三、原核同源重组(E.coli) 发生在双方(DNA分子)DNA的同源区域部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、结合和转导1、RecBCD(外切核酸酶)和 Chi 位点 具有解旋酶(再旋)活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链RecA的作用位点 RecBC

8、D有固定切割位点RecBCD酶的倾向性位点为chi。在E. coli中每隔510kb有一个拷贝。chi由8个碱基组成的非对称序列:5GCTGGTGG33CGACCACC53 RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在双链DNA的平头末端b、外切、解链、移动(ATP)c、兔耳状 loop 结构产生(解旋速度大于释放ssDNA的速度二形成“Rabbit ears” )d、RecBCD 在 loop 单链区的chi 位点3方46NT处切断单链(单链内切酶) chi位点:GCTGGTGG目前发现的重组热点e、RecBCD 切割产生3单链末端当RecBCD结合在DNAChi位点的3侧时,它沿着D

9、NA向5移动使DNA解旋,并降解带有3端的单链。2、RecA 蛋白(1) 活性a、 RecA(MW38kD )有单、双链 DNA 结合活性b、 RecA有 NTPase 活性(底物差异活性)与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNAc、 RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力,即联会同源 DNA(但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA)两双链中必须有一个DNA分子具单链区。其中一个DNA分子必须要有一个游离的3末端,同时单链区和具3端的DNA必须有互补区。在体外RecA引发的反应可产生Holliday结构RecA入侵单链被置换链RecA引发链侵入模型RecA启动的单链入侵(2

10、)RecA蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段a、 联会前阶段(缓慢)RecA与单链结合b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对,形成双链连接分子Holliday(5侵入)c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA反应结束时,RecA结合到双链上 其中单链同化有固定的方向入侵单链为53双链 DNA 的互补链是353、原核同源重组的其它蛋白需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物a、 RuvA识别 Holliday 结构的连接点b、 RuvB 为分枝迁移提供动力(ATPase 1020bp/s)c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Hollida

11、y 结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体4、-酵母MAT序列的转换(mating)依赖同源重组的位点特异性的序列代换1)、 酵母结合型的转变-DNA序列的代换,而不是互换-依赖于序列的同源性(被代换的序列命运是被降解调-突变试验)2)、同源序列W723723723匣子HMLMATMATaHMRaX704704704704Y747747642642Z1239239239239Z288888888total25012501236915853)、 转换过程 内切酶(HO)识别、切割-Y/Z1交界处-起始MAT序列的转换(双链断裂)HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护 Y区域被降解,直到Y 和Ya相同的部

12、分或一直到X区域 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对 以供体DNA为模板复制Y区域,holliday结构形成 Holliday结构的拆分,产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子4)、 特征-同源重组和位点特异性重组特征都具有 需要大范围的同源序列 需要重组酶系(rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶)第二节 位点专一性重组(site-specific recombination)一、位点专一性重组( site-specific recombination)1、概念:发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组2、特征: 在特定的结合序列

13、部位(DNA序列,通常1450bp,序列有的相同,有的不同) ,有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的DNA重排 都具有整合作用的两个基本特征a、 典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上Euk. 中专一性抗体基因的重排 位点专一性重组是在细胞中特定的条件下发生的,它可参与某些蛋白质的表达(如抗体基因),这种专一性的酶是被细胞中的调节因素引发的二、 phage的整合与切除1、实现机制:均是通过-细菌DNA和 DNA上特定位点之间的重组2、特定位点-附着位点(attachment siteatt)E.coliattB 含BOB三序列 2

14、3bp phage attP 含 POP三序列240bp核心序列 “O”完全一致(同源部分)-位点特异性重组发生的地方B,B,P,P-臂3、整合过程 整合后的附着位点为attL(BOP)attR(POB) 整合位点-attB、attP切除位点-attL、attR 整合过程需要 整合酶(integrase Int)( 编码)和寄主的整合宿主因子IHF(integration host factor)共同作用溶源性细菌(lysogen)溶菌周期(lysis)原噬菌体的整合作用有两个特点:这种交换是可逆的,原先存在的DNA顺序全部被保存下来,并无丢失;噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列,重

15、组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。4、整合分子机制 核心序列O全长15bp,富含A-T 发生在O内的重组交换位点相距7bp attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力-高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 整合酶的结合位点:attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同) Int结合(-DNA编码的整合酶 integrase, int )-核心序列的反向位点(切割位置)-结合在att臂上(臂与核心区靠近)在噬菌体感染早期-DNA编码的整合酶大量表达,因此,整合作用几乎发生在每个被侵染的细胞中。整合过程需要整合酶和整合作用宿主因子(IHF,integratio

16、n host factor):IHF是E.coli染色体DNA上himA和himD编码的,由两个亚基组成,MW:20KD。him突变阻止位点专一性重组的发生。intIHFXis 整合体及其作用整合体(intasome)-Int和IHF结合到attP时的复合物 整合体捕获attB说明-a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素 Int蛋白能切断DNA,并使它重新连接,近而使holliday结构拆分 重组时attP和attB部位交叉断裂,互补单链末端进行交叉杂交重组酶的4个亚基分别切开2条双链DNA分子的每条单链完成重组。过程类似于拓扑异构酶的作

17、用。酶的2个亚基的Tyr残基分别进攻DNA,形成DNA的3端以磷酸二酯键与Tyr相连,释放出5-OH端。然后,每个位点的游离5-OH端进攻另一位点的3-P-Tyr,产生Holliday连接。酶的另2个亚基重复此过程使Holliday结构解离。位点特异性重组并非重叠单链末端的退火过程。实际上,每一个双链上相对应的链在同一个位置上被切开,双链间交换游离的3末端。分支沿着同源区移动7bp长的距离,然后,互补的单链末端交互杂合,连接并完成整合过程。噬菌体DNA是环状的,重组时被整合入细菌染色体中,成为线性序列。前噬菌体DNA的两侧成为两个新的杂交att位点,左侧称为attL,由BOP组成;而右侧为at

18、tR,由POB组成。5、整合与切除的控制(1) 整合 C-促使阻遏蛋白C的产生-与int gene 的PI结合,转录产生Int蛋白-且PI位于xis基因内,C与PI结合导致xis gene失活(2) 切除 寄主SOS反应时-RecA大量产生,促使阻遏蛋白C的水解-把OL和OR从阻遏状态释放出来-从PL转录使int和xis表达第三节 转座重组(transposon)一、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element):基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段,它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点(供体和受体)转座(tr

19、ansposition):转座元的转移过程(不十分确切)2、发现和发展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理跳跃基因(jumping gene) 1951 冷泉港实验室(美) Barbara McClintock1980年获诺贝尔奖基因转座现象的再次发现与证实直到1967年Shapiro才在E. coli中发现了转座因子插入型极性突变的发现与机理Operon & Polarity Mutation极性突变的基本概念在一个操纵子中, 与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后,它除了影响该基因

20、本身产物的翻译外,还影响其后结构基因多肽的翻译,并且具有极性梯度的特征。Shapiro在gal操纵子中发现一种极性突变。gal操纵子的galK、T、E基因分别编码gal激酶(galactokinase, K)、gal转移酶(galactose transferase, T)和gal表异构酶(glactose epimerase, E)。Z 基因终止突变位点离O基因的距离IPOZYAA酶活性O genegalm有可能具有小片断DNA的插入。就是插入序列1(insertionsequence1,IS1)。gal+/galm杂合双链DNA的电镜照片,出现了棒糖状结构分子杂交实验:将galm和密度梯度

21、离心实验:Jordon、Starlinger和 gal+进行分子杂交,若有galmShapiro等分别进行了实验,他们将含有gal+ 有额外片段则在电镜下可观察和galm(极性突变,即gal)噬菌体分别分离到它们的存在和所处的位置。出,同时加入到离心管中进行密度梯度离心,实验结果在杂交链上出现了一结果出现了两条带,galm的密度gal+,表明 个额外的茎环结构,长800nt的a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b) 转座不是简单的转移,涉及转座子的复制Hotspots (热点)Regional preference ( 在3kb区域内的随机插入)d) 某些转座因子(Tn3)对同类转座因子

22、的插入具有排他性(免疫性)e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c) 转座插入的靶位点并非完全随机(插入专一型)二、转座子种类和结构特征 两种类型: 简单转座子(simple transposon)(插入序列 insertion sequence IS )复合转座子(composite transposon , Tn ) 共同特征:a)两端有2040bp的IR(反向重复序列 inverted repetitive sequence, IR 或正向重复序列direct repeats, DR )b)具有编码转座酶(transpo

23、sase)的基因1、插入序列 最简单,是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名: IS编号(鉴定类型)长度 7002000bp 特点: a)两端IR为转座酶的识别位点(突变)b)插入靶位点后会出现靶位点的正向重复(39bp) IS 可以正反方向插入到DNA(宿主、质粒或某些噬菌体),常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a) Tn / TnA familyl 具有IR、转座酶基因、 调节基因(解离酶)、抗抗生素基因lTn1Tn3Tn5Tn7(AmpR)(AmpR)(KanR)(StrR TmpR)Tn2Tn4Tn6Tn9(AmpR)(AmpR StrR)(kanR)(CamR)Tn1

24、0 (TetR)2.5 kb20 kbTn3IRTnpA ResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶regulator - 内酰胺酶2、复合转座子 两种类型b)两端重复序列为IS的复合转座子e.g. IS插入到功能基因两端,可能形成复合转座因子ISISIS LISIS R臂中心区臂transposition 当两个IS组件相同时,其中任一个都可行使转座功能 不同时,主要依靠一个 两侧的IS既可以是IR,又可以是DR状态(IR多)U, S毒性蛋白attL, attR 与寄主同源,反向重复,转座必需Gin G区倒位酶ABSUatt R150bp1.5kbG 倒位区 38kbC repress

25、or for A, BB 33 kd 与转座有关A 70 kd 转座酶P att L Cgin3 转座噬菌体 Mu phage (巨型转座子 ) 以E.coli为寄主的温和型噬菌体(溶源、裂解) Mu的插入途径a) 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA(两侧各5bp的靶位点序列重复)b) 进入裂解生长后,复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主DNA中,并可继续转座(形成寄主DNA和Mu的共合体),噬菌体成熟时,切段共合体包装三、转座子的转作机制及模式 三种类型:复制型、非复制型和保守型1、复制型转座(replicative transposition)模式 实质:转座子元件被复制并被移

26、动到受体位点,最终转座过程扩增了转座子的拷贝(供、受点) 需两种酶:转作酶(作用于原拷贝两末端)解离酶(作用于复制后的拷贝) 模式: 两大步a) 共合体形成切口连接复制b) 拆分靶位点的DR形成2、非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有致死效应3、保守型转座模式 另一种非复制型 与 整合机制相似其转座酶与 整合酶家族有关4、TnA转座模式 复制型转座转座酶(tnpA)、解离酶(tnpR) 解离酶需要特异的内部位点双重功能:解离功能tnpA及自身的阻遏物 拆分位点 res共合体拆分位点 转座结果产生5bp的正向重复序列四、转座子转座频率的调控 每个转座子控制自身转座的

27、核心-控制转座酶的水平不到一个转座酶分子世代细胞1、Tn10转座机制 Tn10为复合型转座子 自发转座频率-107 IS10R元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列 Tn10转座酶水平是控制转座的关键 有两种控制转座的方式a) 通过反义RNA的翻译水平控制 IS10R外侧边缘两个启动子 PIN控制IS10R的转录弱启动子 POUT强启动子右向转录宿主DNA INRNA和OUTRNA有36bp的重叠稳定性:OUTRNAINRNA 大量OUTRNA作为INRNA的反义RNAb) 甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合 Tn10转座酶启动子含有GATC序列(其它转座子) E.coli中Dam甲基化

28、酶作用使启动子相对钝化只能利用刚刚复制完成时出现少数转座酶 此外,IS10R的末端IR也含有GATC,甲基化的GATC不能结合转座酶 Tn10在DNA刚刚复制后发生转座五、转座子的某些遗传学效应转座引起插入突变造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复转座产生新的基因转座产生的染色体畸变切除效应六、转座子效应的意义可使原来距离较远的基因组合在一起形成一个操纵子。将原来两段分离的DNA序列连接在一起组成一个新蛋白的基因。启动子部位的插入,使基因打开或关闭。细胞中存在平衡转座过程的途径,避免转座频率过高对细胞的影响。转座基因插入时,大多数受体基因被钝化;但也有被活化的基因;转座子有自己的启动子,在转录转

29、座酶时,其它相邻基因可被转录。第四节 真核生物的转座成分玉米中的控制因子果蝇的P元件反转录转座子酵母的Ty(transponson yeast )元件真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类:a) 转座机制与细菌的转座子类似遗传信息: DNADNA 玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等b) 转作机制类似逆转录病毒遗传信息: RNADNARNA 如:逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的Ty元件在Ds-Ac系统中,大部分自主元件Ac的长度有2.5kb,由含5个外显子的单个基因组成,其产物是转座酶,其末端有11bp的IR,在其靶DNA位点复制形成8bp的DR。各种Ds元件的长度和序列

30、都不相同,末端同Ac一样都有11bp的IR。Ds是Ac转座子的缺失突变体,缺失的长度不同。Ds9仅缺失194bp,Ds6缺失2.5kb,长仅有2Kb,相当于Ac两端各1kb。自主性元件(autonomous elements)有切离和转座的能力。由于自主元件的持续活性,它们可以插入到任何位点,产生一个不稳定的或“可突变”(mutable)等位基因。自主元件本身的丢失就使可变的等位基因变成稳定的等位基因。McClintock还发现了其他系统,这些元件的成员、类型和位置在各玉米品系中都是特异的。每个家族的成员可分为两类:非自主性元件(nonautonomouselements)是稳定的,自己不能转

31、座。当同一家族中的自主性元件存在于基因组中时,不论这自主元件位于何处都能使非自主元件具备转座功能。同一家族的自主性元件能为非自主性元件的转座提供反式作用因子(转座酶),而不同家族间无此反应。果蝇的P元件P转座子引起杂交不育在不同组织中P元件可产生两种蛋白:在体细胞中,仅前2个内含子被剪接,产生了外显子0、1和2编码区,翻译成66KD的蛋白,它是转座激活的阻遏物。在生殖系统中,4个外显子全部拼接在一起形成mRNA,它翻译产生一个87KD的转座酶。P转座子的基因表达:P元件初始转录物有2.5kb或3.0kb两种不同的长度细胞质因子对转座的影响细胞质因子的作用被称为细胞型(cytotype)在含有P

32、元件的品系中有P细胞型,而缺少P元件品系具有M细胞型。细胞型的作用取决于66KD蛋白抑制转座的能力。这个蛋白质是卵中母系因子。在P品系中必须要有足够的蛋白来抑制转座的发生。含有P元件的雌果蝇与无论是否带有P元件的雄果蝇杂交,由于P细胞型的存在抑制了转座酶的合成或激活。但当雌果蝇为M型时,在卵中无阻遏物,这样导致了来自雄果蝇中的P元件使生殖细胞中转座酶活化。P细胞型能对多代后代发挥作用,表明卵中必须要有足够的阻遏蛋白,而且也要相当稳定,通过成体传递到下一代的卵中。反转录子(retroposons)/反转录转座子(retrotransposons)gag编码核心蛋白pol编码逆转录酶和整合酶env

33、编码外壳蛋白病毒的RNA在末端有同向重复序列(Direct repeat),紧挨5端的是80100nt的U5区。在3端前是1701350nt的U3区。DR片段在将RNA逆转录为DNA时被用来产生大量的同向重复序列,这些重复序列能在线形DNA找到,在整合的形式DNA中两端各缺少2bp,是由整合的机制造成的。DNA两端序列 “U3-R-U5”,称为LTR(longterminal repeat,长的末端重复序列)。U5的3端和U3的5端由一个短的IR(反向重复序列)组成, 。原病毒末端有短反向重复序列,其两端有靶DNA的正向重复序列。病毒DNA的末端很重要,末端突变能阻止其整合。紧靠反向重复处存在二核苷酸CA(保守)。整合酶把线形DNA末端与一个核糖核蛋白质复合物结合,并切除保守CA以后的碱基,把平末端转变成凹末端。靶位点是随机的,整合酶在靶位点上交错切口,靶DNA被切除的5端和病毒DNA的3凹陷末端共价连接。病毒DNA一条链的两个末端先被连到靶DNA上,随后单链区被宿主的酶所修复。酵母的Ty(transponson yeast )元件分散的DNA重复序列家族组成,在不同品系的酵母中它们所处的位点不同。转座后在插入的Ty两端靶基因产生5bp正向重复。Ty的转座效率为10-710-8,低于细菌转座子。在不同Ty元件之间有很大的不同。大部分元件属于两个大家族。被称为

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论