植物DNA的提取与鉴定

1、 圣诞快乐！圣诞快乐！ 第第7 7组组 组员：组员：杨曼杨曼、杨芳、朱晨杨芳、朱晨实验目的：实验目的：掌握掌握CTABCTAB法从植物叶片提取法从植物叶片提取DNADNA的原理和方的原理和方法法掌握紫外光照射法鉴定掌握紫外光照射法鉴定DNADNA的原理和方法的原理和方法实验内容：实验内容：采用采用CTABCTAB法从植物叶片中提取法从植物叶片中提取DNADNA。采用紫外光照射法鉴定采用紫外光照射法鉴定DNADNA 1 1. .核酸是生物有机体中的重要成分，在核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以以核核蛋白蛋白的形式存在。的形式存在

2、。 在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使和细胞膜，使核核蛋白被释放出来。蛋白被释放出来。 2 2. .CTABCTAB(hexadecyltrimethylammonium (hexadecyltrimethylammonium bromide,bromide,十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵) )，是一，是一种阳离子去污剂种阳离子去污剂, ,具有从低离子强度溶液具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB(0.7mol/L NaC

3、l),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸沉淀核酸. .通过有机溶剂抽提，去除蛋白、通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。核酸分离出来。 （CTABCTAB法的全称法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法是十六烷基三甲基溴化铵法（Hexadecyltrimethy Ammonium BromideHexadecyltrimethy Ammonium Bromide）。）。实验试剂实验试剂 CTABCTAB提取缓冲液提取缓冲液 洗涤缓冲液洗涤缓冲液：( (76%76%乙醇，乙醇

4、，10mmol/L10mmol/L乙酸铵乙酸铵共共100ml100ml：76mL76mL无水乙醇，无水乙醇，0.077g0.077g乙酸铵，乙酸铵，加水到加水到100mL100mL) ) T E T E 缓 冲 液缓 冲 液 ( 1 0 m m o l / L T r i s - H C L ( 1 0 m m o l / L T r i s - H C L （pH7.4pH7.4），），1mmol/L EDTA )1mmol/L EDTA ) 氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇（24 24 ：1 1） 70% 70% 乙醇乙醇 液氮液氮实验器材实验器材冷冻高速离心机冷冻高速离心机台式高速离心机台式高

5、速离心机移液器移液器水浴锅水浴锅 37100 37100 陶瓷研钵陶瓷研钵离心管离心管 50ml 50ml，有盖，有盖 离心管离心管 5ml 5ml和和1.5ml 1.5ml 小玻棒小玻棒 形状为弯成钩状的形状为弯成钩状的 天平天平 1 1 ，将，将10mLCTAB10mLCTAB提取缓冲液加入提取缓冲液加入50mL50mL离心离心管管中，置于中，置于6060水浴水浴中预热。中预热。2 2 ，称取，称取1.5g1.5g叶片，置于预冷的叶片，置于预冷的研钵研钵中，中，倒入液氮，尽快将叶片研碎至成粉末。倒入液氮，尽快将叶片研碎至成粉末。3 3 ，取，取1g1g粉末直接加入预热的粉末直接加入预热的C

6、TABCTAB分离缓分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。冲液中，轻轻转动使之混匀。4 4 ，将磨碎液分倒入将磨碎液分倒入1.5 ml1.5 ml的灭菌离心管的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；中，磨碎液的高度约占管的三分之二；5 5，置于，置于6565的水浴槽或恒温箱中，每隔的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min10 min轻轻摇动，轻轻摇动，3060min3060min后取出；后取出； 6 6，冷却，冷却2 min2 min后，加入氯仿后，加入氯仿- -异戊醇（异戊醇（2424：1 1）至满管，充分混匀至满管，充分混匀23 min23 min7 7，放入离心机中，放入离心机中10000

7、rpm10000 rpm离心离心10 min10 min，与此，与此同时，将同时，将600 ul600 ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；管中； 8 8， 10000 rpm 10000 rpm离心离心1 min1 min后，移液器轻轻地吸后，移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动管慢慢上下摇动30 s30 s，使异丙醇与水层充分混合，使异丙醇与水层充分混合至能见到至能见到DNADNA絮状物；絮状物；9 9，10000 rpm10000 rpm离心离心1 min1 min后，立即倒掉液体，

8、注意勿将后，立即倒掉液体，注意勿将白色白色DNADNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 10, 60 s 10, 60 s后，直立离心管，加入后，直立离心管，加入720ul720ul的的75%75%乙醇及乙醇及80 80 ul 5 Mul 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的底的DNADNA块状物浮游于液体中；块状物浮游于液体中； 11 11，放置，放置30 min30 min，使，使DNADNA块状物的不纯物溶解；块状物的不纯物溶解； 12 12，10000 rpm10000 rpm离心

9、离心1 min1 min后，倒掉液体，再加入后，倒掉液体，再加入800 800 ul 75%ul 75%的乙醇，将的乙醇，将DNADNA再洗再洗 30 min 30 min； 13 13，10000 rpm10000 rpm离心离心30 s30 s后，立即倒掉液体，将离心管后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNADNA（自然风干或用风筒吹干）；（自然风干或用风筒吹干）； 14 14，加入，加入50 ul 0.5 50 ul 0.5 TE( TE(含含RNase)RNase)缓冲液，使缓冲液，使DNADNA溶溶解

10、，置于解，置于3737恒温箱约恒温箱约15 h15 h，使，使RNARNA消解消解 紫外光照射法：紫外光照射法： 1 1配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭（的溴化乙锭（EBEB）溶液。）溶液。 2 2将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴纸上，再滴一滴EBEB溶液染色。溶液染色。 3 3将蜡纸放在紫外灯（将蜡纸放在紫外灯（260 nm260 nm）下照射）下照射（暗室中），可见橙红色的萤光（暗室中），可见橙红色的萤光（DNADNA的的紫外吸收高峰在紫外吸收高峰在280 nm280 nm处）。处）。 1，在在DNAD

11、NA提取、制备的过程中，核酸极不稳提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：定，许多因素可破坏其完整结构： 化学因素，核酸的结构在化学因素，核酸的结构在pHpH值值4.04.011.011.0间较稳定，间较稳定，pHpH值在此范围外就会使核酸变性值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。降解，故制备过程应避免过酸过碱。 物理因素，物理因素，DNADNA分子链很长，是双螺旋结分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令强机械作用如剧烈搅拌会令DNADNA分子断裂，分子断裂，不利于收集，

12、应加以避免。不利于收集，应加以避免。酶的作用，细胞中普遍存在的酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解它会降解DNADNA分子。故须用酶的变性剂、分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低抑制剂使之失活。操作过程最好在低温温(0(0左右左右) )下进行。下进行。 ,2 2，所有操作均须温和，避免剧烈震荡。所有操作均须温和，避免剧烈震荡。 1.1.用酚抽提细胞用酚抽提细胞DNADNA时，有什么作用？时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了使蛋白质变性，同时抑制了DNaseDNase的降解作用。用苯酚处理匀浆

13、液时的降解作用。用苯酚处理匀浆液时, ,由于蛋白与由于蛋白与DNA DNA 联结键已断联结键已断, ,蛋白分蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。溶于水相。 2.2.氯仿的作用？氯仿的作用？ 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的迹量最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）酚。（酚易溶于氯仿中）3.3.异戊醇的作用？异戊醇的作用？ 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，