亚硝基胍诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中p53、ras基因表达和(精)

1、亚硝基胍诱发大鼠胃腺癌发生发展过程 中p53、ras基因表达和突变的研究New Page 1【摘要】目的探讨 p53、ras 基因在亚硝基胍（N-methyl- N nitro -N-nitrosoguanidine，MNNG 诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中的作用。方法 用免疫组织化学、 聚合酶链反应-单链构象多态性分析 （PCR- SSCP技术对大鼠正常腺胃粘膜、癌前病变和胃腺癌组织中p53, ras 基因的表达和突变进行检测。结果 p53 蛋白在癌组织中的阳性表达率为 50%（20/40 只），正常和癌前病变组织中为阴性；ras 蛋白（p21）癌前病变组织中阳性率为 44%（23/52只），

2、在癌组织中为 23%（9/40 只）。癌组织中 p53 基因突变率为 45%（18/40 只） ，非癌组织为阴性。癌组织及癌前病变组织中均未发现ras 基因突变。结论 在 MNN 诱发大鼠胃腺癌发生发展过程中，ras 基因的激活是一早 期事件，可能参与了癌的发生过程，而 p53 突变则主要与胃癌的进展有关。Expressi on and mutati on of p53 and H-ras genes in the carc inogen esisand developme nt of gastric ade nocancinoma in duced by MNNG in rats Meng

3、Zhenha ng, Lei Dao nian, Wang Jia ng, et al. Departme nt of Pathology, Beijing MedicalUni versity, Beijing 100083.【Abstract 】 Objective To investigate the effect of p53 and H-ras genes inthe carci nogen esis of and developme nt of gastric cancer induced by N-methyl- N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)

4、 inWistar rats. Methods The expressi on of p53 and H-ras genes in no rmal mucosa,preca ncerous lesi ons and in duced-ca ncers were studied immun ohistochemically.DNA isolated from the preca ncerous lesi on and tumors were an alysized byPCR-SSCP for exon 5-8 of p53 gene and exon 1 and 2 of H-ras gene

5、. Results p53protein were detected in 50% (20/40) of the gastric can cers studied, but not in thepreca ncerous lesio n, while p21 ras protein see n in 23% (9/40) of the gastric can cersand 44% (23/52) of the preca ncerous lesi ons. p53 gene mutati ons were detected in45% (18/40) of the can cers and

6、none in the precancerous lesions by PCR-SSCP.H-ras gene mutation was not found in either the can cers or the preca ncerous lesi ons.Con clusi ons The activati on of ras gene is an early eve nt and may be invo Ived in thecarc inogen esis of gastric can cer in duced by MNNG. In activat on of p53 gene

7、mayin flue nee the developme nt of the can cer.【Key words 】 An imal test ing alter natives Stomach n eoplasmsGenes,p53 Genes, ras大量研究显示，细胞癌变及恶性肿瘤的形成是多因素、多阶段、多基 因变异所致的结果。癌变过程的每一个阶段都存在癌基因和抗癌基因一系列变 化1，2。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的一种抑癌基因3，4, p53基因的缺失和突变可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤的发生。p53 基因通常与异常激活的癌基因协同作用5。许多研究也表明， ras 基因

8、的激活与多种人类肿瘤 的发生密切相关6。亚硝酰胺类化合物是与人类胃癌发生密切相关的致癌剂， 我们利用其代表物亚硝基胍(MNNG 诱发大鼠胃腺癌和癌前病变模型，并对p53基因、 H-ras 基因在不同病变组织中的表达和突变进行了研究，旨在探讨p53、H-ras 基因在胃癌发生发展过程中的作用。材料与方法1. 实验性胃癌模型： Wistar 雄性大鼠 90 只(北京医科大学实验动物中 心提供)。4 周龄，体重 4555g,分为模型组 80 只，对照组 10 只，分笼常规 饲养。模型组动物饲水中加入 MNN，终浓度为 8X104卩 g/L,连续用药 9 个 月，停药后继续常规饲养至 12 个月。对照

9、组动物饮用自来水。实验满 12 个月 时乙醚麻醉下处死动物，将胃沿大弯侧切开，在胃窦部沿小弯侧及肿瘤部位取 材，用于石蜡切片，另取 0.51.0g 新鲜组织提取 DNA。2. 免疫组化染色：用 ABC 法, p53 抗体(CM-5)由英国 Dundee 大学 Davie教授赠送，H-ras(259)单抗购于 Santa Cruza 公司，ABC 试剂盒购于 Vector 公司。用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。结果判断：组织中至 少有一群粘膜(腺)上皮细胞胞浆(p21ras)或胞核(p53)有明显的 DAB 染色(棕黄 色)者判断为阳性。实验以正常大鼠胃粘膜组织作阴性对照，以已知阳性胃

10、癌标 本作阳性对照。3.PCR 反应：用蛋白酶 K-酚-氯仿方法提取癌前病变、 胃癌组织 DNA 正常对照用正常大鼠胃粘膜组织。 用 PCFT增 p53 基因第 5、6、7、8 外显子及 H-ras 基因第 1、2 外显子，引物序列及有关资料见附表。PCR 反应体系为 25卩 l，含模板 DNA 15(250 ng，上下游引物各 50 pmol，Taq DNA 聚合酶 1U。 反应条件：94C变性 2 分钟，然后 94C45 秒，退火温度和时间见附表，72C30 秒，35个循环后 72C延伸 5 分钟，反应完成后，取 5 卩 l PCR 产物 1.5%琼 脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。附表 p53

11、、H-ras 基因 PCRT 增引物序列基因 外显引物序列(53)产物长度退火温度C)时间(s)p535ACT CAA TTT CCC TCA ATA AG180 BP4650CAC CAT CAG AGC AAC GCT CA6TAT TCT TGC TCT TAG GCC TG235 bp5540GAG TCT TCC AGC GTG ATG AT7CCG GGT AGT GGG AAT CTTCTG G 206 bp5840AAG GGG TGA CTT TGG GGTCAA8GAG GTG AGC AGG CAG GAC152 bp5040AAG GGT GAA ATA TTC TCC

12、ATC GH-ras1TGA TTC TCA TTG GCA GGT GG152 bp5035GAG CTC ACC TCT ATA GTG G2CCC GAA ACA GGT AGT CATTGA T 152 bp5035GGT CAC CTG TAC TGA TGGATG T4.SSCP 分析：取 5 卩 l PCR 产物与等量加样缓冲液（95%去离子甲酰 胺，20 mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青蓝）混合，沸水中煮 10 分 钟变性后迅速放入冰浴中，上样于 8%聚丙烯酰胺凝胶（29 : 1），在 1XTBE 中电 泳，4C,50 V，12 小时。电泳结束后将

13、凝胶置于含 30%L 醇和 10%酸的溶液 中平缓摇动 10小时（固定），然后 30%乙醇漂洗 2 次，每次 10 分钟，再用三蒸 漂洗 3 次，每次10 分钟。0.1% AgNO 溶液染色 30 分钟，三蒸水快洗，2.5% NaCQ0.02%甲醛中显影至条带清晰，用 1 聽酸终止显色反应 5 分钟。玻璃纸 封胶自然风干，可长期保存。结果1. p53 基因、ras 基因蛋白表达的免疫组化结果：胃癌组织中p53 蛋白阳性颗粒均在胞核中（1），阳性率为 50%（20/40 只）。早期癌 p53 蛋白 5 只阳 性，进展期胃癌 1 5 只阳性（包括 2 只有肝转移者 ） 。癌前病变组织及正常对照组

14、胃粘膜未见 p53 阳性染色。p21ras 在肠化和异型增生组织中阳性率为 44%（23/52 只），胃腺癌中为 23%（9/40 只），在少数形态正常的粘膜腺颈部或底 部可见少数散在的p21 阳性细胞。p21 蛋白定位于胞浆和胞膜（2）。1 胃腺癌组织 p53 蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于细胞核ABC法X200 2 胃粘膜肠上皮化生组织 p21 蛋白免疫组化阳性，棕黄色颗粒定位于 细胞浆ABC 法X2002. PCR-SSCP 吉果： 与正常对照比较，存在突变的肿瘤标本呈现异常条 带，包括单链条带泳动变位、缺失或多带。胃癌组织中 p53 突变率为 45%（18/40 只），见 3， 其

15、中第 5 外显子 7 例， 第 6 外显子 11 只突变， 癌前病变 组织未见突变。 PCR-SSC与免疫组化结果相比有 3 只不一致，其中 2 只免疫组 化阳性，而 PCR-SSC 阴性，1只免疫组化阴性。而 PCR-SSC 阳性。p53 基因第 7、 8 外显子未见突变。 ras 基因第 1、 2 外显子在癌前病变及癌组织中均未发现 突变。箭头所指为异常泳动带，N:正常对照组织，T:肿瘤组织 3 p53 基因 第 5 外显子（左），第 6 外显子（右）SSCP 吉果讨论近年来人们对 p53 和 ras 基因的研究倾注了极大的热情。研究显示， p53基因的失活及 ras 基因的激活在人类肿瘤

16、发生发展过程中起着重要作用， 但对 MNN诱发动物实验性胃癌过程中 p53 和 ras 基因改变研究极少。本实验用 MNN 所诱发的大鼠胃癌均为腺癌，其发生过程也与人类胃癌相似，即多经历由 胃粘膜腺体肠上皮化生、不典型增生到癌变的过程。进一步研究显示，MNN 在诱发大鼠实验性胃癌发生发展过程中引起 p53 基因突变，并可激活 H-ras 基因 使其表达升高，但不引起 H-ras 基因突变。人类野生型 p53 基因定位于染色体 17p13,突变热点为 58 外显子， 大鼠p53 基因定位于 11 号染色体。野生型 p53 基因表达的蛋白半衰期甚短，一 般检测方法难以检出，而当基因发生突变时，其表

17、达的蛋白质构型发生改变， 半衰期延长，因此免疫组化测得的 p53 蛋白为突变型蛋白7。野生型 p53 基因 在正常细胞生长分化过程中起着负调控作用。而突变的 p53 基因则失去了野生 型 p53 功能，能与激活的 ras 基因一起转化原代细胞3。 p53 基因的缺失或突变 可引起细胞恶性增殖，导致肿瘤发生。我们的研究显示，p53 基因突变集中在 第 5、6 外显子，可能为 MNN致癌的特异性改变。提示检测胃癌组织中p53 基因的突变情况对推测其病因有一定意义，可为胃癌的预防提供依据。我们研究 显示p53 基因突变多出现在进展期胃癌，提示 p53 基因突变可能与胃癌进展有 关，与Kakeji 等

18、8的观点一致。许多研究表明 ras 基因的激活与细胞癌变有关，很多恶性肿瘤中有 ras 基因的突变和 ras 蛋白的过量表达。我们的实验结果表明， ras 蛋白高表达 出现在肠化和异型增生的胃粘膜组织中，而癌组织中阳性率反而降低。 PCR- SSCP 佥测在胃癌组织及癌前病变组织中均未发现突变，提示可能是MNN 通过某种不使基因突变途径激活 H-ras 基因， H-ras 基因的高水平表达与细胞增殖 有关。在 9 只 ras 蛋白呈阳性表达的胃癌标本中有 7 只 p53 蛋白也呈阳性染 色，两者存在相关性，显示 p53 基因的突变和 H-ras 基因的激活在胃癌的发生 发展过程中有一定的协同作

19、用。参考文献1 Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science, 1987, 226：235-242.2 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectaltumorigenesis. Cell, 1990, 61：79-86.3 Hinds P, Finlay C, Levine AJ. Mutation is required toactivate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. JVirol, 1989, 63：739-743.4 Levine AJ, Momond J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene