HPLC测定蜂蜜中链霉素残留量

1、hplc测定蜂蜜中链霉素残留量 一、试验目的 把握hplc法检测蜂蜜中的链霉素残留量的原理与办法。 二、试验原理 蜂蜜样品中的链霉素残留以磷酸溶液提取，阳离子交换柱和c18固相萃取柱净化，旋转蒸发浓缩后，以庚烷磺酸钠溶液溶解，经高效液相色谱分别、柱后衍生后，通过荧光检测器测定，与标准品比较，实现定性和定量分析。 三、仪器与试材 1仪器与器材 高效液相色谱仪(配柱后衍生装置和荧光检测器)、水浴锅、液体混匀器、旋转蒸发器、真 空固相萃取装置、微量进样器等。 2试剂 除特殊解释外，试验中全部试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。 (1)常规试剂：甲醇、乙腈、正己烷、hac、h3po4、k2hpo4、

2、kh2po4、庚烷磺酸钠ch3(ch2)6so3·na、1，2一萘醌一4一磺酸钠(c10h5nao5s)、叔丁基甲醚ch3oc(ch3)3、苯磺 酸型阳离子交换柱(500mg，3ml)、c18固相萃取柱(500mg，3ml)、玻璃棉(磷酸浸泡，备用)。 (2)标准品：链霉素(纯度95)。 (3)常规溶液：h3po4溶液(o1，体积分数，ph一2)、磷酸缓冲溶液(ph=8，0.2moll)、naoh溶液(02moll)、庚烷磺酸钠溶液(o.5moll)、ph-3.3的庚烷磺酸钠溶液(0.01moll，以hac调ph值)、叔丁基甲醚一正己烷混合溶液(4+1，体积比) (4)链霉素标准储备

3、溶液(0.40mgml)：储存于4冰箱中。 (5)链霉素标准工作溶液：用ph-37.3的庚烷磺酸钠溶液将链霉素标准储备溶液稀释成o、 o.02mll、o.04mll、o.06mll、o.08mll、o.1mll、o.2mgl的标准工作溶液。 3试验材料 23种蜂蜜，各250g。 四、试验步骤 1样品提取 (1)对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌匀称备用；对有结晶的蜂蜜样品，在密闭状况下，置于不超过60的水浴中温热，振荡，待样品所有溶化后搅匀，快速冷却至室温，备用。 (2)取1000g蜂蜜置于150ml锥形瓶中，加入25ml h3p04溶液，在液体混匀器上高速混合5min，使试样彻低溶解，即为样品提取

4、液。 2净化 (1)将苯磺酸阳离子交换柱先用5ml甲醇和10ml水预洗并保持柱体潮湿。 (2)在真空固相萃取装置上，将样品提取液以1.5mlmin的流速通过苯磺酸阳离子交换柱。 (3)分离用5ml h3po4溶液和10ml水淋洗阳离子交换柱，弃去所有淋洗液。 (4)用30ml磷酸缓冲溶液以1.5mlmin的流速洗脱离子交换柱上的链霉素，收集洗脱液。 (5)在洗脱液中加入3ml庚烷磺酸钠溶液，摇匀，再用磷酸调整ph至2，备用。 (6)在真空固相萃取装置上，将洗脱液以1.5mlmin的流速，通过c18固相萃取柱(以5ml甲醇和10ml水预洗并保持柱体潮湿)。 (7)用5ml h3po4溶液淋洗c1

5、8固相萃取柱，在真空泵65kpa负压状况下，减压抽干5min。 (8)以4ml叔丁基甲醚一正己烷混合溶液淋洗c18固相萃取柱，再减压抽干5min，弃去所有 淋出液。以10ml甲醇以15mlmin的流速通过c18固相萃取柱，洗脱链霉素。 (9)收集洗脱液，于旋转蒸发器45水浴中减压蒸发至干。以1.0 ml庚烷磺酸钠溶液溶解 残渣，供液相色谱测定。 3测定 (1)分离取80l标准工作溶液和样品溶液，上样至hplc仪，以色谱峰高对标准溶液中组 分的肯定量绘制标准曲线，求出样品提取液中链霉素的含量。 (2)参考色谱条件：色谱柱为hypersil c18柱(150mm×46mm，5m)；流淌相

6、为将1.10g 庚烷磺酸钠、o.052g 1，2萘醌-4-磺酸钠溶于500ml乙腈-水溶液(27+73，体积比)中，以hac 调整ph至3.3；流淌相流速为10mlmin；检测器波长，激发波长为263nm，放射波长为435nm；色谱柱温度为50；衍生管为10m×o.25mm(内径)不锈钢衍生管，衍生剂为naoh溶液，衍生管温度为50，衍生剂流速为o.4mlmin；进样量为80l。 4计算 按下式计算样品中链霉素的含量： x=cv/m 式中，x为样品中链霉素的残留含量，mgkg；c为样品净化液中链霉素的浓度，gml；v为样品溶液的终于定容体积，ml；m为净化液代表样品的质量，g。 五、注重事项 1试验步骤中的色谱条件仅供参考，在试验中应按照仪器的型号和试验条件，通过准备试验来确定最佳的色谱条件。 2在本试验色谱条件下，链霉素的保留时光约为9min，也可以通过调节洗脱液中乙腈的比例，来控制链霉素的出峰时光。 3本试验办法链霉素