HLA抗原单克隆抗体分型技术

1、hla抗原单克隆抗体分型技术 具高度多态性的hla糖蛋白大多表达在有核细胞的表面。应用微量淋巴细胞毒技术，将外周血单个核细胞（pbmc)与抗hla特异性抗体（同种抗血清或单克隆抗体）及兔补体混合培养，计数死亡细胞比例来推断结果。 【材料】 1专用单联、六联加样器：1ml,5ml两种； 2无菌水； 3矿物油； 4固定液：伊红与，或一步法终止液stain fix; 5应用荧光法：荧光终止液（fqae）代替伊红与甲醛； 6配型板笼罩玻璃片或terasaki密封板； 7相差倒置显微镜（应用荧光法：荧光相差倒置显微镜）； 8专用单克隆抗体分型板（普通用亚洲型asn)。 【办法】 1.淋巴细胞分别办法有

2、（1）细胞分别剂（t-kwik或b-kwik ) (2）ficoll-hypaque法； (3）磁珠分别法（fluor-beads)。 2基本操作步骤 （1) hla单克隆抗体冷冻板分型技术 1)溶化：将配型板放置室温15分钟（补体已加于冷冻板内）； 2）加细胞：每孔加l ml淋巴细胞。细胞含量为每1 ml 200万个左右； 3）混匀：用静电混匀器或细小的金属丝； 4)孵育：室温（2025）下孵育1分钟； 5）终止反应：荧光法加5 ml fqae；一般染色法加5 ml stain fix或5m1伊红，2分钟后加5 ml； 6）密封：用terasaki密封板或玻璃片密封试剂板； 7)读板及描述反

3、应：终止反应后15分钟可读板。按照细胞死亡数的百分比推断抗原抗体反应（nih计分法，表10-4）。 (2) hla-i类、ii类单克隆抗体分型技术 1)溶解补体：加1 ml冷无菌水（25）于干燥补体管内；轻轻摇摆补体管，促进溶解；用法前温度保持在25（放置含有冰块的器皿中）；立刻分装剩余补体并储存于-20或以下冰箱中；补体冻融不得超过1次。 2）操作步骤：每孔加1 ml无菌水溶解抗体，溶解后，保持在25（不要超过2小时）；每孔加5m1矿物油；每孔加l ml t淋巴细胞（i类）或b淋巴细胞（ii类），细胞含量为2x106/ml;每孔加1 ml补体并混匀；37水浴孵育1小时；每孔加5ml伊红，2分

4、钟后加5 ml（最好用stalntm一步法stain fix) ;用terasaki密封板或玻璃片密封试剂板；应用荧光法者，第6步改为：每孔加5ml fqae。 (3) hla-b27单克隆抗体板分型技术 1)溶解补体：用冷无菌水溶解补体（25 ）。应用前放在有冰的器皿上； 2）溶解抗体：加1 ml无菌水于b27板含有抗体的孔中； 3）加细胞：每孔加1 ml细胞。细胞含量为2x106/ml左右； 4)加补体：每孔加1 ml溶解的补体并混匀； 5）加矿物油：每孔加5 ml矿物油（防止挥发）； 6）置7孵育1小时； 7）加染色液：每孔加5ml stain（染色液）； 8)结果：相差倒置显微镜下推断

5、细胞存活情况。 【结果】 按照细胞死亡的百分比推断抗原抗体反应。伊红染色，在相差倒置显微镜下可见活细胞呈光明，死细胞呈深暗色。应用荧光法，在荧光相差倒置显微镜下活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色。目前，国际上通用nih办法计分，详见表10-4。每块配型板均附有一份反应记录表（code sheet)，将阳性反应结果读数填到相应孔空格内。每一批号的配型板都附有反应格局推断表，以协助指定相应的抗原。 【注重事项】 1常见问题与解决办法 (1)本底过高，死细胞过多，浮现假阳性。常见干细胞分别和所用试剂不当。其解决方法为：充实细胞分别办法。最好用免疫磁珠法，一般倒置显微镜可观看t磁珠分别的t细 胞，但b磁珠

6、分别b细胞需荧光显微镜；分别出的淋巴细胞应溶于5的mccoy's液中。 (2）细胞量过少或过多。其解决办法是在加细胞前先检测细胞含量。 (3)每孔细胞不匀称。其解决办法是用软加法，即先将加样器吸一点空气，再吸取细胞或试剂。 (4)反应弱。其解决方法为：避开应用rpmi可抑制抗原表达）；检测试剂ph（偏高可抑制反应）；加样后用静电混合器或金属丝混匀；延伸孵育时光。 2单克隆抗体冷冻板注重事项 (1)保证冷冻板的储存环境，对于立式-80冰箱，应存放在最底层； (2)溶化的板不应再次冷冻，溶化后尽快应用，不要超过1小时； (3）操作过程中避开加样器接触板底，防止造成交错污染； (4)避开个别

7、孔漏加细胞。 3单克隆抗体hla-b27分型注重事项 (1)补体在应用前，始终保持在冷环境中（放置在有冰的器皿上）。补体对温度比较敏感； (2)剩余补体立刻冷冻储存，补体冻融不超过1次；有条件的单位，补体宜一次性用法； (3)每块板含3人或6人份，不同标本加样时避开交错污染； (4）一次未能用尽的板，可将剩余的抗体溶解后加5微升矿物油低温储存。冻融不超过1次； 4. hla-、类单克隆抗体分型，频繁的问题与解决办法如下。 (1)本底过高，即死细胞过多，浮现假阳性。常见于分别细胞和所用试剂不当。其解决办法是充实细胞分别办法，可用40的percoll液去掉死细胞，分别出的t细胞应溶于5的mecoys中； (2）细胞量过少或过多，其解决办法是在加细胞前先检测细胞浓度； (3)每孔细胞不匀称。其解决办法是用软加法，即先将加样器吸一点空气，然后再吸取细胞或试剂。 (4)反应弱。其解决办法为：避开补体反复冻融，防止个别孔补体漏加；避开应用rpmi 1640培养液可抑制抗原表达）；应检测试剂ph（偏高可抑制反应）；加样用用静电混合器或金属丝混匀；检测hla-ii类时，如t细胞或单核细胞污染，需改进细胞分高办法；将分别出的b细胞先在37孵育30分钟，然后再点板。 (5）应注重以下事