瘦素通过GSK3介导的OMA1泛素化降解途径增加OPA1表达以提高骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力

1、瘦素通过GSK阶导的OMA泛素化降解途径增加 OPA1表达以提高骨髓间充质干细胞的抗凋亡水平研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌细胞缺血缺氧性损害,出现程序性凋 亡或坏死,产生左室病理性扩张及左室射血分数降低.心肌细胞再生水平有限导 致心肌梗死区的死亡心肌细胞被成纤维细胞替代,产生无收缩功能的胶原瘢痕组 织,最终导致缺血性心肌病、心力衰竭的发生.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗急性心肌梗死的治 疗效果已在许多大型灵长类动物实验及临床试验中得到证实. MSCift有低免疫 原性、多向分化潜能、干性维持及获取方便等优势.但是,心梗后不利的微环境导致移植到

2、心梗周边区的细胞存活率很低,这成为MSCst效治疗的瓶颈.我们团队以往的研究发现缺氧预处理(hypoxiapreconditioning,HP)的MSCSi勺存活水平明显增强,通过对正常培养的MSCsa缺氧预处理MSCsW组细胞的基因组芯片分析,发现缺氧预处理能明显上调 MSCs勺 瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能参与了 MSCs治疗心肌梗死的作用.然而,瘦素是否通过独立保护 MSC抗凋亡而促进其疗效以及相应的分子机 制尚不清楚.为此,本博士研究课题将首先着力于证实瘦素是否具有保护MSCs抗凋亡的作用.线粒体的形态结构和稳态的维持是细胞存活的必要条件.线粒体脊结构破坏 将导致其中富含

3、的许多前凋亡因子从线粒体中释放到胞浆,而启动凋亡信号通路.线粒体稳态(融合与分裂)的动态平衡是维持正常细胞线粒体功能的重要条 件,线粒体分裂有利于去除细胞内受损的线粒体,但过度分裂也会启动线粒体自 噬导致细胞凋亡.瘦素是脂肪细胞分泌的肽类激素,在平衡能量代谢、神经内分 泌及调节免疫系统方面都有广泛作用.许多研究发现瘦素对线粒体有潜在调控作用.在乳腺癌细胞(MCF-7)中给予瘦素处理后,发现线粒体的动力学稳态和功能有着明显改善；瘦素这一线粒体调 控作用在瘦素缺失的ob/ob小鼠中也得到进一步证实.已有文献提出瘦素对心肌细胞的抗凋亡保护作用.因此,本博士论文课题同 时也将就瘦素是否同样通过对 MS

4、C级粒体形态结构及其稳态的调节而发挥抗凋 亡而保护MSCS勺生存展开研究.第一局部：在体内和体外模型中验证瘦素对骨髓间充质干细胞的存活水平的 影响目的：在体内和体外模型中验证瘦素对 MSCS勺存活水平有无影响方法与结 果:在体实验局部,首先,别离培养人骨髓来源的问充质干细胞(hMSCs),并利用带 有GFPfe记瘦素过表达质粒的慢病毒感染 hMSCS±表达瘦素,以便将过表达瘦素 的hMSC形植到急性心梗C57BL/6J小鼠心脏治疗备用.我们将C57BL/6J小鼠随 机分为三组(每组20只)：I )心肌梗死(MI)组小鼠给予瘦素过表达hMSCS台疗 (hMSClep); H)MI组小鼠

5、给予同等细胞数量病毒质粒载体感染hMSCS台疗(hMSCvec); m)MI组小鼠给予相同注射体积的 DMEM!.我们的结果显示：I)在心梗术后3天取材小鼠心脏,切片荧光共染GF讲口 TUNELWhMSC疗活率.与病毒空载组(vector)相比拟,移植病毒过表达瘦素 的hMSCSfi中的hMSCSffl胞存活率明显提升(p=0.01).n)在心梗后28天进行超声心动图检测心功能和天狼星红染色评价梗死面 积发现,瘦素过表达hMSCSfi小鼠的心功能和梗死面积均较对照组有明显缓解. 通过术后28天检测血管新生相关标记物提示：hMSCs通过旁分泌效应增强血管 新生而改善心梗后心功能.体外实验建立缺糖

6、缺氧缺血清 (glucose and serum deprivation under hypoxia,GSDH)的hMSC胡导凋亡模型模拟在体心梗体内不良微环境.在常氧下 将hMSCS合予瘦素(50 ng/ml)预处理24小时后,再暴露于GSD喇?取24小时.通过Annexin V/PI染色、TUNE染色和剪切型caspase 3凋亡蛋白的检测, 发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCiffl的细胞在凋亡应激环境中的抗凋亡水平 明显增强.我们收集细胞培养的条件上清液,进彳THUVEC田胞的matrigal管腔形 成实验,发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCsfi的条件上清液使HUVEC胞管腔 形

7、成最明显,进一步证实hMSCs勺旁分泌效应.第二局部：在体外研究瘦素对间充质干细胞的线粒体动力及功能的改变及其 机制探索目的：线粒体是细胞凋亡中重要的细胞器,通过分析线粒体结构和动力 的相关调控因子,进一步探索瘦素对hMSCs勺线粒体改变的机制方法与结果：在 预处理瘦素(50ng/ml)24小时后,再将hMSC进彳T GSD甥导凋亡24小时.通过 细胞透射电镜观察hMSCs勺超微结构,发现瘦素预处理hMSC升的线粒体明显增 粗增长、脊膨胀；而对照组的线粒体形态那么是稀疏、短小的点状样.但是细胞氧耗量的检测发现瘦素预处理组的 hMSCs：匕对照组明显减少,提示 我们在凋亡模型中瘦素只对线粒体形态

8、的完整性有保护作用,而对改善线粒体的 氧化磷酸化功能没有作用.进一步分析线粒体动力相关因子,发现在瘦素预处理 hMCSisa中,线粒体上调控内膜融合与分裂的因子 Optic atrophy 1(OPA1)的蛋白 水平明显上调,但在基因水平无变化.OPA促与动力相关GTFW样蛋白,位于线粒体内膜上,调节线粒体内膜的融 合与分裂、维持脊结构.OPAK至少5个亚型,主要为长亚型色、坊和短亚型9、d、e).有趣的是,长亚型OPA1L-OPA1和短亚型OPA1S-OPA1的功能截然相 反,L-OPA1调控线粒体内膜融合,S-OPA1限制线粒体内膜分裂.我们发现,在瘦素 预处理组的hMSC的的L-OPA1

9、明显增多,这符合电镜下观察到的线粒体增粗延长 提示线粒体的病理性融合.通过siRNA进行细胞OPA1的特异性基因沉默方式,证实瘦素对hMSCS勺抗凋 亡保护作用依赖于OPA1因子.进一步分析调控OPA1的因子后发现,在瘦素预处 理hMSCSfi,另一个线粒体内膜蛋白OMA酌降解增多.已有文献报道,OMA11 OPA1W负性调节作用,OMA酌降解增加符合上述观察 到的OPA1的蛋白水平表达增多.同时,我们发现瘦素通过GSK筋酸化激活而启 动OMA的泛素化P$解途径,并且给予GSK3勺抑制剂SB216763阻止了 OMA1的 降解作用,提示OMA的泛素化降解依赖于GSK翁酸化激活.结论:在急性心肌梗死后的恶劣的微环境中,1瘦素能够通过维持线粒体脊 结构的完整性而增强hMSCS勺抗凋亡