单分子检测技术

1、单分子检测单分子检测Single Molecules Detection 高等分析化学与实验高等分析化学与实验2Outline of my presentationvIntroductionHistory and background Single Molecules Detection(SMD)vSMD in modern chemistry Electrochemical Detection Fluorescence Spectroscopy Localized Surface Plasmon Resonance(LSPR) A33Push your research into extre

2、mes! Extremely small space (sub micrometer to nanometer) Extremely low concentration (pico molar, femto molar 10-15, atto molar) Dynamic environment (binding, conformation changing, diffusion)Single Molecules D4定义定义v1.1. 单分子检测技术是检测灵敏度达到分子水平的单分子检测技术是检测灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术。一系列高灵敏检测技术。v2.2.单分子检测是分析化学家长

3、期以来梦寐以求的单分子检测是分析化学家长期以来梦寐以求的一一项富有挑战性的前沿领域项富有挑战性的前沿领域,达到了分子检测灵敏达到了分子检测灵敏度的极限度的极限,是物质低含量监测技术中最后一个里程是物质低含量监测技术中最后一个里程碑。碑。v特点：检测空间尺度在纳米数量级特点：检测空间尺度在纳米数量级, ,检测的分子数检测的分子数目或相关事件一般在几个目或相关事件一般在几个( (次次) )到几千个到几千个( (次次) )的范的范围。围。5背景背景 我们为什么需要单分子检测？我们为什么需要单分子检测？ 对超灵敏度检测技术的需求！对超灵敏度检测技术的需求！ 例：例：AIDS的研究的研究 未检出未检出不

4、存在不存在6 2 3光学方法光学方法, ,包包括表面增强拉括表面增强拉曼光谱、共聚曼光谱、共聚焦荧光显微法焦荧光显微法等等扫描探针显微扫描探针显微方法方法, ,包括扫包括扫描隧道显微镜描隧道显微镜等等 研究方法研究方法 1化学方法化学方法, ,包包括电化学检括电化学检测，化学发测，化学发光检测等光检测等7 共同特征共同特征123单分子检测的研究方法单分子检测的研究方法高空间分辨能高空间分辨能力；力；单分子性质单分子性质和行为的捕和行为的捕获能力；获能力；能收集微弱信能收集微弱信号并放大检测号并放大检测, ,并做相应的分并做相应的分析处理以获取析处理以获取可信的信息。可信的信息。8单分子电化学检

5、测单分子电化学检测v 溶液中分子在两个电极间进行反复循环氧化还溶液中分子在两个电极间进行反复循环氧化还原反应原反应,形成回路和可测量的电流形成回路和可测量的电流,据此可进行据此可进行SMD.v 通过使用特制的纳米微电极，将少量待测电通过使用特制的纳米微电极，将少量待测电活性分子捕获在纳米微电极与基底之间；在扩散活性分子捕获在纳米微电极与基底之间；在扩散作用下，分子穿梭于微电极与基底之间，从而形作用下，分子穿梭于微电极与基底之间，从而形成电流，通过检测形成的电流从而实现单分子的成电流，通过检测形成的电流从而实现单分子的检测。检测。v可以确定半反应电势自由能及反应动力学可以确定半反应电势自由能及反

6、应动力学9单分子电化学检测单分子电化学检测v单分子的电化学检测的两个前提条件单分子的电化学检测的两个前提条件: v (1)要能独立检测发生在纳米尺度空间的反应要能独立检测发生在纳米尺度空间的反应变化变化,实现对有限个数分子的捕获。（使用纳米微实现对有限个数分子的捕获。（使用纳米微电极）电极）v (2)需要把反映单分子行为的微弱信号放大到需要把反映单分子行为的微弱信号放大到可以检测的程度。可以检测的程度。10单分子电化学检测单分子电化学检测检测分子：三甲铵甲基二茂铁检测分子：三甲铵甲基二茂铁 (Cp2FeTMA+)电解质：电解质：NaNO3电极：电极：Pt-Ir微电极，包裹在纳米级厚微电极，包裹

7、在纳米级厚 度的蜡鞘中。度的蜡鞘中。基底：导电基底基底：导电基底检测方法：扫描电化学显微镜，并采用检测方法：扫描电化学显微镜，并采用 正反馈工作模式实现信号放大正反馈工作模式实现信号放大, 检测到检测到pA级电流。级电流。结果：探针电流呈现离散变化。结果：探针电流呈现离散变化。 电流值为电流值为0. 5 pA、1. 0 pA和和0 pA的概率大的概率大,这这3个电流值分别对应着在个电流值分别对应着在探测空间中存在探测空间中存在1个、个、2个或个或0个电活性个电活性分子。分子。11单分子电化学检测单分子电化学检测 检测分子本身检测分子本身的电荷变化，是的电荷变化，是一种直接检测；一种直接检测；几

8、乎不影响被测几乎不影响被测对象；适合和其对象；适合和其他方法联用他方法联用优点缺点 电极制备复电极制备复杂，合格率较杂，合格率较低；电极不一低；电极不一样，实验结果样，实验结果重现性不好。重现性不好。12单分子荧光检测单分子荧光检测v基本原理基本原理:在激光照射下在激光照射下,荧光分子从基态到激发荧光分子从基态到激发态态,发射光子回到基态。根据荧光寿命和分子在激发射光子回到基态。根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间光束中停留时间,可算出单个分子发射的最大光子可算出单个分子发射的最大光子数为数为105106。目前光学检测系统收集、检测。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为光子的效率约为1%或

9、或0.5%5%,故单个分子故单个分子仍可被检测到数千光子信号。仍可被检测到数千光子信号。v检出限约为检出限约为10-13mol/L，应用最广！，应用最广！13单分子荧光检测单分子荧光检测单分子的识别单分子的识别 1.光谱法；光谱法； 2.荧光寿命法，纳秒级；荧光寿命法，纳秒级； 3.光子爆发量光子爆发量(强度强度)，分子不同，分子不同,荧光量子产率荧光量子产率等光物理性质不同等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；导致发射的光子数不同； 4.时间分辨荧光各向异性。时间分辨荧光各向异性。14单分子荧光检测单分子荧光检测 操作基本无太操作基本无太大难度，易于实大难度，易于实现；检测效率比现；检测效

10、率比较高；可进行实较高；可进行实时监测时监测优点缺点 测定生物大测定生物大分子如蛋白质分子如蛋白质和核酸需要进和核酸需要进行外部标记行外部标记15局域表面等离子体共振检测局域表面等离子体局域表面等离子体是存在于金属纳米粒子或不连续是存在于金属纳米粒子或不连续的金属纳米结构中的电荷密度震荡。的金属纳米结构中的电荷密度震荡。局域表面等离子共振局域表面等离子共振是当金属纳米粒子被入射光激是当金属纳米粒子被入射光激发时发时,因内部自由电子的协同振荡而产生的共振。因内部自由电子的协同振荡而产生的共振。1616光与金属纳米颗粒的相互作用过程：激发光携带一定强度的电场自由电子在电场中开始振荡激发电场和电子的

11、振荡形成共振自由电子吸收能量被共振激发自由电子返回基态并释放能量能量形式：热能 + 发射光子(散射光)局域表面等离子体共振17LSPR传感器v理论上所有的金属、合金、半导体材料都可以做理论上所有的金属、合金、半导体材料都可以做成成LSPR传感器，常用金、传感器，常用金、 银、铂等贵金属。银、铂等贵金属。LSPR的吸收光谱峰值处的吸收波长取决于材料的吸收光谱峰值处的吸收波长取决于材料的微观结构特性，如组成、的微观结构特性，如组成、 形状、形状、 大小、大小、 局域局域传导率。传导率。18LSPR传感器19单分子电化学检测单分子电化学检测 无需标记；无无需标记；无污染、实时、高污染、实时、高灵敏度灵敏度优点缺点 纳米颗粒制纳米颗粒制备复杂；信噪备复杂；信噪比低；对检测比低；对检测器要