2016植物生理学试验

1、2016植物生理学实验植物S0D酶活性的测定、实验目的学习掌握用氮蓝四瞠(NBT)法来测定植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活力。 了解不同盐浓度胁迫对水稻幼苗叶片SOD酶的影响。二实验原理 SOD发现:1938年Mani等人首次从牛红血球中分离得到SOD。 SOD分布:广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。 SOD类型：SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子自其类型有Cu/Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD0由基的酶,DMAProteinsU0d盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响(1)在一定盐度的胁迫下，植物叶片中

2、SOD活性随盐浓度的升高而增强。(2) SOD酶能有效抑制膜脂过氧化作用，具有一定的保护作 用。因此，盐胁迫的损伤在一定范围内是可以修复。然而，膜系统的修复与SOD、CAT、POD等抗氧化酶的 活性和抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物含量的 变化密切相关。SOD测定方法直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。间接法（化学法）:邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、轻胺 法、黄嚓吟氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性， 因而采用间接法测定。常用有3种：氮蓝四瞠光化还

3、原法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法。NBT法测定SOD酶活性的原理在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄 素极易再氧化而产生氧自由基，可将氮蓝四瞠还原为蓝色的甲腺，甲腺在560nm处有最大吸收。而SOD可清除 氧自由基，从而抑制了甲腺的形成。光还原反应后，反应液蓝色愈深， 说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。酶单位/样品量=7x-区座被抑制-口可于 3 曰口口里（50%）x3加反应混合液中加入的样品量核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产 生氧自由基。氮蓝四哩(NBT):氧自由基将无色(或微黄)的NBT还原为蓝色甲腺。甲硫氨酸： 提供核黄素的还原反应

4、所需的电子供体， 使 得核黄素的光激发还原反应得以进行。 SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成与H2O2,从而抑制蓝色甲腺形成。SOD催化反应如下:O； + O； +2H+ SODH2O2+O2二、实验材料、仪器与试剂材料：水稻幼苗盐胁迫处理后的叶片。仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器, 荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管数支，研钵，烧杯, 离心管，量筒等。试剂：SOD抽提液：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）14.5mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：现配现用。2.25mmol/L氮蓝四哩溶液（NBT） :避光保存， 现配现用。60円nol/L核

5、黄素溶液：避光保存，现配现用。3 pimol/L EDTA一 溶液主要试剂配制（供参考）:（1）50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）:A液：2比卩04 2比0（分子量156.01）: 3 12g溶于蒸馆水，定溶至lOOmLB液：NHPOq 12比0（分子量358.14）: 7 17g溶于蒸徭水, 定溶至lOOmL取A液8 5ml与B液91.5ml混合，定容至400ml, pH7.8o(2)SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液含0.1mmol/L EDTA;0.3%(w/v) Triton X-100; 2-4% (w/v)聚乙烯聚毗咯烷酮(PVP ) ,pH7.8o即每升磷酸缓冲液中

6、加20g PVP, 200） 11 0.5mol/L的EDTA母液,3mlTriton X-100o(3)14 5mmol/L甲硫氨酸(分子量149.21):称2.163g溶于蒸憾水，定溶至1000ml(较难溶，需稍微加热)。(4)2.25mmol/L NBT(分子量817.7):称92mg溶于50ml 50mM磷酸磷酸缓冲液(pH7.8),现配现用, 避光保存。(5)60jimol/L核黄素(分子量376.36)称2.25mg溶于50ml 50mM磷酸磷酸缓冲液(pH7.8),现配现用, 避光保存。(6)3jimol/LEDTA-Na2(分子量372.24):A、0.5mol/L :称9.3

7、06g溶于蒸憾水，定容至50ml。 (注意：搅拌时用NQOH 调pH至8.0才能完全溶解)。B、0.5mmol/L :取A液lml用蒸馆水稀释定容至1000ml。C、3giol/L :取B液3ml用磷酸缓冲液稀释定容至500ml。三、实验步骤酶液提取将经盐胁迫处理、称好保存的水稻叶片0.2-0.5g置于预冷的研钵中， 加l-2ml预冷的SOD提取液在冰浴上研磨 成浆，并转移到离心管中，再用提取液清洗研钵，每次lml,转移到同一离心管中， 终体积不超过4ml;于6000-8000rpm下离心5-10 min,上清液即为SOD酶粗提 液，置于冰箱保存备用。反应体系试剂用量（ml/管）50 mM S

8、OD提取液1.514.5 mM甲硫氨酸0.32.25mM NBT0.33 jiM EDTA-Na20.360JLLM核黄素0.3蒸馆水0.25酶液0.05 （2支对照管以提 取液代替酶液）总体积3.0做预实验：以确定最佳酶液浓度酶液稀释：取其中一管酶液按1倍、10倍、100倍 稀释。混合液配制：计算4-5支试管的用量，按反应体系 表中各溶液（除酶液外）配制1份混合液（现用现配）。加酶液：在每支试管中加混合液2.95ml,再分别 加入相对应的酶液量， 其中2支空白对照用提取液 代替酶液，混匀，马上用黑色塑料袋罩住。照光反应： 取1支对照管于暗处， 其余放在试管架上， 于4000LX日光灯下反应2

9、0min（要求各管受光情况一致，光 照时间视具体情况而定，如光照强、温度高则时间缩短，反之则延长，时间要严格控制）。今天实验的照光时间约2 5min左右。终止反应： 照光完毕马上用黑色塑料袋罩住试管架， 以终 止反应。 SOD活性测定：以不照光的对照管做空白，分别测定各管OD值。确定酶液加入量：以抑制率在35%-65%为佳。正式实验准备6支相同型号的试管：4支样品、2支对照。混合液配制：按6-8支试管的用量配制（同预实验）o加酶液：各管加入混合液2.95ml, 4支分别加入相对应的酶液量，2支对照管用提取液代替，混匀，遮光。照光反应：取1支对照管置暗处，其余各管进行照光反应，时 间根据预实验进

10、行调整。终止反应：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住试管架，终 止反应。 SOD活，性测定：以不照光的对照管做空白调零，逐一迅速测 定各管在560 nm处的OD值。结果计算一个SOD酶活性单位的确定:按最初测定SOD活性时的设计，以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。如NBT在光照下被还原为蓝色甲腺，检测0D560=0.5;但在反应系统中加入酶,SOD催化歧化为H2O2和。2,与NBT竞争，部分抑制了NBT还原成蓝甲腺的反应，检测0D560=0.25, NBT的光化还原刚被SOD抑制50%,则此时加入的酶量为一个SOD酶单位。计算SOD活性:SOD总活性：以每克鲜重酶单位表示。SOD比活力：以酶单位/mg蛋白表示。人煦：照光对照管的吸光度；A:样品管的吸光度；V:样品液总体积(ml) ; V,:测定时样品用量(ml);SOD总活性=丄如尹竺 血蔦X护“SOD比活力=SOD总活性 蛋白质浓度W:样品鲜重(g)o蛋白质浓度单位：mg蛋白/g鲜重。五、注意事项研磨样品时提取液要分次加入，用提取液洗研钵，并全 部转移到离心管中，控制总量不要超过4ml。除正在研磨的样品外，其它余样品或提取好的粗酶液均 保存在冰箱备用。混合液的配制、分装及加酶液的过程中均应注意避光。做好预实验确定酶液加入量，以抑制率在35%-65%为佳