利用HPLC法测定注射用黄芩苷原料中黄芩苷及有关物质的含量

1、利用HPLC法测定注射用黄苓苷原料中黄苓苷及有关物质的含量在今天， 黄芩苷在我国的临床医疗中应用越来越广泛， 但是 与其相关的中药制剂有关物质的研究报道却很少， 为了能够有效 的提高黄芩苷用药的安全性， 就需要对相关的黄芩苷原料药的生 产和使用进行全面的探究， 在探究的过程中， 不断的提升其应用 的安全性和有效性， 从而使得其在临床医学中的应用会越来越广 泛。本文就利用HPLC法测定注射用黄苓苷原料中黄苓苷及有关 物质的含量进行了简要的探究，具体报道如下。1、材料本文研究所采用的仪器主要为分析天平、 HPLC仪、泵、脱 气机、自动进样器、检测器、柱温箱以及色谱工作站，并对各类 仪器的型号进行合

2、理的配置，以保障测定工作可以有效的开展。 同时在药品和试剂上要做好相应的选择， 所选择的测定药品为注 射使用的黄芩苷原料， 而其中的对照品需要选用多种， 主要包括 黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素 A-7-O 葡萄醛酸苷，另外选择的色 谱纯为甲醇，分析纯为磷酸，同时还需要准备一定量的水，而准 备的这些水需要能够对离子具有去除作用。2、方法2.1 色谱条件2.1.1 检测波长的选择需要选用适量的黄芩苷、 千层纸素 A-7-O 葡糖醛酸苷、 汉黄 芩苷对照品以及注射使用的黄芩苷原料， 采用流动相来对这些物 质分别进行溶液的配置，在配置完成后，每种溶液选取一定量， 对其进行紫外扫描，注意扫描的波长要控制在

3、 200-800nm 之间， 根据扫描的结果可以看出，各种对照品溶液的波长均在 274nm 处，并且具有较大的吸收效果， 而注射使用的黄芩苷原料溶液的 波长处于274nm外其他的位置，而且其在扫描的过程中，并没有 出现杂质峰， 因此， 可以将注射用黄芩苷原料溶液的波长认定在 274nm处。除此之外，还需要采用二极管阵列检测器对各种配置 的溶液进行详细的检验， 以保障溶液检验的合理性， 在检验过后， 可以得到一个吸收光谱， 而从所得的吸收光谱中， 可以明显的验 证黄苓苷以及其中的各种杂质其波长均在274nm处，具有较强的吸收能力。2.1.2 流动相的选择就有关的资料显示， 在本文的实验中， 采用

4、甲醇作为流动相， 采用这种溶液作为流动相做研究， 由研究的结果可以了解到， 黄 芩苷与各个成分之间所保留的时间相对来说比较均衡， 其中的主 要构成成分，相对来说具有较好的峰形，在研究结果中，还可以 看出，其中的黄芩苷峰和其他物质的色谱峰均能够有效的满足分 离度的实际标准。2.2 破坏性试验在进行加速破坏的过程中，需要选用NaOH乍为实验溶液加入到注射用黄芩苷原料所配置好的溶液中，注意所选择的 NaOH 溶液的浓度分别为 1mol/L 、0.5mol/L ，而加入的注射用黄芩苷 原料所配置的溶液量为2ml，然后对溶液的变化情况进行观察， 可以明显的发现，在 NaOH加入之后，黄苓苷马上就出现了分

5、离 或者是变性的现象，而且其中的主成分的色谱峰也立刻就消失， 使得加速破坏试验的有效性丧失。 因此， 在进行加速破坏试验的 过程中， 所选择的添加溶液应该是较为温和的碱性溶液， 也就是 对相应的NaOH容液的浓度进行降低处理，最好采用0.05mol/L的NaOH加入到注射用黄苓苷原料所配置的溶液中。2.3 溶液的制备2.3.1 供试品溶液的制备称取注射用黄苓苷原料样品约 5.0mg，用50%甲醇溶解并定 容至 50ml 量瓶中，作为供试品溶液。2.3.2 对照品溶液的制备 （1）黄芩苷对照品溶液：准确称取黄芩苷对照品适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度约为100卩g/ml的黄苓苷对照品溶

6、液。（ 2）有关物质混合对照品溶液：准确称取千层纸素 A-7-O 葡糖醛酸苷对照品和汉黄芩苷对照品各适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别约为100卩g/ml的有关物质混合 对照品溶液。2.3.31%对照溶液的制备精密量取供试品溶液 0.5ml ，置 50ml 量瓶中， 用 50%甲醇稀 释至刻度，摇匀，作为 1%对照溶液。2.4 有关物质测定方法取供试品溶液和对照品溶液各20卩l，按上述色谱条件注入HPLC仪，记录色谱图至主成分保留时间的4倍，以供试品溶液色谱图中各杂质峰峰面积、所有杂质峰峰面积总和分别与1%对照溶液中黄芩苷色谱峰的峰面积比较，计算有关物质的质量分 数。2.5 线性关

7、系考察2.5.1 黄芩苷的线性关系考察分别取黄苓苷对照品溶液 5、10、15、20、25、30卩l，按 上述色谱条件注入HPLC仪测定，记录峰面积。以峰面积积分值(y)对质量浓度(x,卩g/ml )进行线性回归，得回归方程为 y=34241x-42184 (r=0.9999 , n=6)。结果表明，黄苓苷的质量 浓度在50.00300.00卩g/ml范围内与其峰面积积分值呈良好 线性关系。2.5.2 千层纸素 A-7-O 葡糖醛酸苷的线性关系考察 取混合对照品溶液适量，用 50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.21、1.27、2.33、3.39、4.45、5.51、6.57 卩 g/ml 的系列溶

8、 液，按上述色谱条件各进样 10卩l，记录峰面积。以峰面积积分 值(y)对质量浓度(x,卩g/ml )进行线性回归，得回归方程为 y=36082x-3390.2 (r=0.9993 , n=7)。结果表明，千层纸素 A-7-0 葡糖醛酸苷的质量浓度在 0.216.57卩g/ml范围内与其峰面积 积分值呈良好线性关系。 2.5.3 汉黄芩苷的线性关系考 察取混合对照品溶液适量，用 50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.16、0.32、0.48、0.64、0.80卩g/ml的系列溶液，按上述色 谱条件各进样10卩l，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质 量浓度（x，卩g/ml ）进行线性回归，得回归方

9、程为 y=42799x-1049.5 （r=0.9993 , n=5）。结果表明，汉黄苓苷的质 量浓度在0.160.80卩g/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线 性关系。3. 结果黄芩苷、 千层纸素 A-7-O 葡糖醛酸苷、 汉黄芩苷的质量浓度分别在 50.00 300.00、0.21 6.57、0.16 0.80 卩 g/ml 范围内 与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（ r 分别为 0.9999、 0.9993、 0.9993）；平均加样回收率分别为 99.16%、 100.69%、 99.18%, RSD分别为 1.2%、2.4%、4.6% （ n 均为 9）。黄苓苷与 有关物质分离良好， 千层纸素 A-7-O 葡糖醛酸苷与汉黄芩苷的检 出限分别为 0.43、 0.64ng。4. 讨论样品中汉黄芩苷的质量分数很低， 致使本试验中汉黄芩苷重 复性、精密度、稳定性及加样回收率试验的 RSD>2%但仍符合 微量试验对方法学的要求。 与化学原料药相比， 注射用黄芩苷原 料中同源杂质种类多、含量高，针对这种情况，笔者对其中的部 分杂质建立了定