第一节免疫标记技术的基本概念 ppt课件

1、 第一节 免疫标志技术的根本概念一、免疫标志与标志免疫的概念二、常用的免疫标志物质 免疫标志与标志免疫免疫标志技术：免疫标志技术：标志物与免疫活性物质的联接技术标志物与免疫活性物质的联接技术标志免疫技术：标志免疫技术：以标志免疫物质检测相应靶物质的技术以标志免疫物质检测相应靶物质的技术常用的免疫标志物质常用的免疫标志物质类别 标志物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属

2、颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 第二节 酶标志技术一、常用标志方法二、标志免疫物的分别与鉴定常用标志方法常用标志方法1、常用酶 辣根过氧化物酶HRP 碱性磷酸酶AP2、标志方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法戊二醛交联法戊二醛交联法 (一步法一步法抗体-NH2 + COH-CH23-COH + NH2-酶抗体-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶抗体-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-抗体酶-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶戊二醛交联法二步法戊二醛交联法二步法COH-CH23-COH + NH2-酶抗体-NH2 + CHO-CH23-CH = NH

3、2-酶抗体-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环标志免疫物的分别与鉴定标志免疫物的分别与鉴定1、分别 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标志物纯度 第三节 荧光标志技术一、常用标志方法二、标志免疫物的分别与纯化常用标志方法常用标志方法1、荧光素的概念2、生物标志荧光素的要求3、常用荧光素标志原理与方法 生物标志荧光素的要求生物标志荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的才干2、荧光效率高3、能与背景物质构成鲜

4、明对比4、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标志方法平安、简便6、标志物稳定，易保管FITCFITC的标志原理与方法的标志原理与方法荧光素-N=C=S + NH2-抗体荧光素-N-C-N-抗体H S HRB200RB200的标志原理与方法的标志原理与方法荧光素-SO3Na + PCl5荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体 荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl 标志免疫物的分别与鉴定标志免疫物的分别与鉴定1、分别 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析2、鉴定 抗体活性 标志物结合度 F/P比值的应意图义 第四节 放射性核素标志技术一、常用标志方法

5、二、标志免疫物的分别与纯化常用标志方法常用标志方法1、常用放射性核素2、125I 的标志方法 直接法氯胺T法 间接法衔接法直接法氯胺直接法氯胺T T法法OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T间接法衔接法间接法衔接法CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP间接法衔接法间接法衔接法CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白质H O H+ NH2-蛋白质125

6、I125I标志免疫物的分别与鉴定标志免疫物的分别与鉴定1、分别 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性mCi/mg应意图义本章小结本章小结1、免疫标志技术的概念2、常用免疫标志物质及其标志方法3、标志免疫物质的分别与鉴定思索题思索题1、何谓免疫标志技术？2、常用的免疫标志物质有哪些？3、酶标志的主要方法有哪些？4、F/P比值的实意图义如何？5、何谓比放射性？有何意义？ 第一节 标志免疫技术的分类一、按指示标志物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术按

7、指示标志物质划分的类型按指示标志物质划分的类型1、均相型homogenous2、非均相型heterogeneous按测定方式划分的类型按测定方式划分的类型均相型均相型homogenous非均相型非均相型heterogeneous双标志均相荧光免疫测定双标志均相荧光免疫测定酶扩展免疫测定技术酶扩展免疫测定技术1、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型按测定用途划分的类型 第二节 酶联免疫吸附实验一、ELISA技术的原理与方法二、 ELISA技术的操作留意要点ELISA技术的原理与方法技术的原理与方法间接法 夹心法 竞争法间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法酶标仪酶标仪酶标仪酶标仪ELI

8、SA技术的操作留意要点技术的操作留意要点试剂器材操作环节 适宜任务浓度 第三节 荧光抗体技术一、荧光抗体技术的原理与方法二、荧光抗体技术的操作留意要点荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法直接法间接法补体法双标志法 直接法间接法补体法双标志法荧光抗体技术的操作留意要点荧光抗体技术的操作留意要点标本处置染色操作 结果观测荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜运用原理荧光显微镜运用原理激发滤片BG吸收滤片OG标本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650激发滤片激发滤片吸收滤片吸收滤片荧光滤镜运用原理荧光滤镜运用原理 第四节 放射免疫测定技术一、放射免疫测定技术的原理与方法二、放射免疫测定技术的操作留意要点结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法放射免疫分析法的原理与方法1 2 5 10 20 50 10040302010未标志抗原含量未标志抗原含量结结合、合、游游离离相相放放射射性性含含量量比比值值液闪仪液闪仪计数器计数器放射免疫测定技术的操作留意要点放射免疫测定技术的操作留意要点反响的温度与时间结合相与游离相的分别免疫标志技术的比较免疫标志技术的比较 FIA ELISA RIA敏感性 较低 高 高特异性 高 高 高反复性 差 好 好检测对象