实验三+伪狂犬病抗体检测ppt课件

1、实验四、伪狂犬病抗体检测实验四、伪狂犬病抗体检测阻断阻断ELISA)酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 将知的抗原或抗体吸附在固相载体将知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微聚苯乙烯微量反响板量反响板)外表，从而使酶标志的抗原抗体反响在外表，从而使酶标志的抗原抗体反响在固相外表进展，根据参与底物的颜色反响来断定能固相外表进展，根据参与底物的颜色反响来断定能否有免疫反响的存在。否有免疫反响的存在。 一、实验目的一、实验目的了解了解ELISAELISA的原理和类型的原理和类型掌握阻断掌握阻断ELISAELISA操作

2、程序操作程序二、实验原理二、实验原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体外表，抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体外表，并坚持其免疫学活性；并坚持其免疫学活性；抗原或抗体可经过共价键与酶构成酶结合物，而抗原或抗体可经过共价键与酶构成酶结合物，而此种酶结合物仍能坚持其免疫学和酶学活性；此种酶结合物仍能坚持其免疫学和酶学活性；酶结合物催化底物发生化学反响，根据颜色的有酶结合物催化底物发生化学反响，根据颜色的有无和深浅断定抗原抗体反响的发生与否。无和深浅断定抗原抗体反响的发生与否。间接间接ELISAELISA 2 2阻断法测定抗体阻断法测定抗体A.A. 将抗原吸附在固相载体外表将抗原吸附在固相载体外

3、表; ; B. B. 先加待检血清抗体先加待检血清抗体, , 构成抗原构成抗原- -抗体抗体复合物复合物; ; C.C. 再加酶标单抗；再加酶标单抗；D. D. 加底物。加底物。单抗单抗血清？血清？底物显色底物显色阻断阻断ELISAELISA 4 4竞争法测定抗原竞争法测定抗原A. A. 抗体吸附在固相载体外表抗体吸附在固相载体外表; ; B. B. 同时参与酶标抗原和待测抗原，竞争结合同时参与酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；抗体； 对照只参与酶标抗原；对照只参与酶标抗原； C. C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。未知抗原量。酶标板，酶

4、标仪酶标板，酶标仪包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液猪伪狂犬病毒猪伪狂犬病毒PRVPRV 抗原抗原样品稀释液：样品稀释液： pH7.4 PBS pH7.4 PBS三、实验资料三、实验资料 阴性对照阴性对照EPEP管中，已稀释管中，已稀释 阳性对照阳性对照EPEP管中，已稀释管中，已稀释 样品样品 待测猪血清待测猪血清EPEP管中，已稀释管中，已稀释 APAP标志猪标志猪PRVPRV单抗单抗 酶标单抗酶标单抗EPEP管中，已管中，已稀释稀释 洗涤液：含洗涤液：含0.05% Tween 200.05% Tween 20的的0.01M p

5、H7.4 0.01M pH7.4 PBSPBS青瓶青瓶常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物反应后颜色反应后颜色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）邻苯二胺（邻苯二胺（OPDOPD）棕黄色棕黄色碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMBTMB）蓝色蓝色n底物缓冲液：底物缓冲液： pH5.0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液n底物溶液：底物溶液：TMBTMB四甲基联苯胺，底物缓冲液，四甲基联苯胺，底物缓冲液，30% H2O230% H2O2，新颖配制，新颖配制n终止液终止液1.1.抗原处置：抗原处置：2.2.抗原包被：抗原包被：以洗涤液以洗涤液20

6、0L/200L/孔洗涤孔洗涤3 3次，次，3min/3min/次次四、实验方法四、实验方法3.3.加待测血清：加待测血清：标志各孔，参与相应液体标志各孔，参与相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性待待测测阳阳性性待待测测4.4.加单抗：加单抗：3737，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液以洗涤液200L/200L/孔洗涤孔洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔参与酶标单抗各孔参与酶标单抗100L/100L/孔孔3737，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液以洗涤液200L/200L/孔洗涤孔洗涤3 3次，次，3min/3m

7、in/次次参与底物溶液参与底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min,10min,加终止液加终止液1 1滴滴6.6.察看结果察看结果取稀释好的被检血清取稀释好的被检血清2 2份和阴、阳性对照血清，每孔参与份和阴、阳性对照血清，每孔参与100l100l，置，置3737温育温育3030分钟。分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔参与稀释好的洗涤液洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔参与稀释好的洗涤液200l200l，静置，静置3 3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，反复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，反复3 3次。次。每孔加酶标单抗每孔加酶标单抗100l100l，置，置3737温育温育3030分钟。

8、分钟。洗板：同步骤洗板：同步骤2 2。显色与终止：每孔先加底物显色与终止：每孔先加底物A A液、再液、再B B液各液各1 1滴滴(50l)(50l)，混匀，室温，混匀，室温18-25 18-25 避光显色避光显色1010分钟后。分钟后。终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液1 1滴滴(50l) (50l) 0.25% 0.25% 氢氟酸，终止反响。氢氟酸，终止反响。1010分钟内测定结果。采用波长分钟内测定结果。采用波长630nm630nm的酶标仪测定的酶标仪测定ODOD值。值。结果断定：实验成立的条件是：阴性对照孔平均结果断定：实验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630OD630值与阳性对照值

9、与阳性对照孔平均孔平均OD630OD630值之差值之差0.40.4。S=S=样品孔样品孔OD630OD630值，值，N=N=阴性对照孔阴性对照孔OD630OD630值值假设假设S/NS/N比值比值0.60.6，样品断定为，样品断定为PRVPRV抗体阳性抗体阳性; ;假设假设S/NS/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，样品可疑，样品可疑; ;假设假设S/NS/N比值比值 0.7 0.7，样品断定为，样品断定为PRVPRV抗体阴性。抗体阴性。五、结果与分析五、结果与分析n 阴阳性对照样品的阴阳性对照样品的OD630 OD630 ? ?n S/NS/N? ?，被检血清是阴，被检血清是阴/

10、/阳性？阳性？n 结果与预期的不符，能够的缘由是什么？结果与预期的不符，能够的缘由是什么？l 阳性：无色阳性：无色l 阴性：蓝色阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性阴性阴性被检被检单抗单抗血清？血清？底物显色底物显色被检被检？ ELISAELISA前血清样品前血清样品3737灭活灭活3030分钟。分钟。 在在ELISAELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽能够除去未的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽能够除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。结合的抗原及杂质，用力甩干。 参与底物液后应室温避光，结果判别须在参与底物液后应室温避光