X312基因工程的基本操作程序

1、1 12 23 34 4外显子外显子内含子内含子5 5结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰成熟成熟mRNA6 67 7从基因文库中提取目的基因从基因文库中提取目的基因1 基因文库(gene library)概念n又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。n基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。8 8基因文库的分类按照外源按照外源DNADNA片段的来源：片段的来源：u从特定组织提取的染色体基因组从特定组织提

2、取的染色体基因组DNADNA - -基因组基因组DNADNA文库文库（总）（总）umRNAmRNA反转录成的反转录成的cDNAcDNA拷贝拷贝-cDNAcDNA文库文库（部分）（部分）基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。下，便于获得所需的目的基因。9 9基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库1010u基因文库基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相应基因，而是应基因，而是保存受体菌保存受体菌，菌，菌中含基因中含基因1111利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一项在生物：是一项在生物体外体外复制特定复制

3、特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。原理：原理：DNADNA双链复制双链复制原料：模板原料：模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；离子酶）；离子1212n模板DNA （已知碱基序列）n 特异性引物（DNA）n耐热DNA聚合酶（Taq酶）n dNTPs （4种脱氧核苷酸）nMg+(促进dNTP与核酸骨架作用)PCR体系基本组成成分1313PCR的基本反应步骤变性90-95C延伸70-75C退火55-60C第三步：将反应体系升温第三步：将反应体系升温至至7075 ，在耐高温的，在耐高温

4、的DNA聚合酶催化作用下，聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的酸加到引物所提供的3-OH上，使上，使DNA链延伸合成链延伸合成，产生一条与模板链互补的产生一条与模板链互补的DNA链。链。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至9095 ，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温第二步：将反应体系降温至至5560 ，使，使两种引两种引物分别与模板物分别与模板DNA链配对链配对结合结合，这个过程称为复性。，这个过程称为复性

5、。141453355335变性变性1515533555ABAB退火退火1616533555Taq酶酶延伸延伸11717533555延伸延伸21818()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2019192020模板DNA952121PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物2222PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶2323PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始2424PCRPCR的基本

6、原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq2525PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束2626PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 27272828292930303131QPCR是针对特定是针对特定DNA片断片断的快速体外复制增殖技术的快速体外复制增殖技术Q每循环

7、一轮，目的基因的每循环一轮，目的基因的量可增加一倍量可增加一倍Q增殖速率为增殖速率为2n,（n为循环为循环次数）次数） 每完成一个循环需每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3232PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成 。 b b、复性（复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部 。

8、c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的 。 氢键单链DNA双链DNA链3333 从基因文库中获取从基因文库中获取 利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法3434质粒质粒DNADNA分子分子切口黏性末端切口获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种 限制酶3535构建表达载体构建表达载体组成组成 目的基因目的基因 启动子启动

9、子 终止子终止子 标记基因标记基因目的：目的：使目的基因在受使目的基因在受体细胞中稳定存在；可体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥的基因能够表达和发挥作用。作用。复制原点复制原点插入基因插入基因终止子终止子抗生素抗性基因抗生素抗性基因表达载体表达载体启动子启动子3636将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法3737将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 显微注射法显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）仪注射到受精卵中）383

10、8将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2处理处理受体细胞受体细胞成为感受成为感受态细胞，态细胞，再进行混再进行混合。合。3939目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 检测检测: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译 鉴定鉴定: : 功能活性鉴定功能活性鉴定 抗性鉴定抗性鉴定4040DNA分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术抗原抗体杂交技术检验受体细胞染色体的检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检验目的基因是否转检验目的基因是否转录出了录出了mRNA检验目的基因是否表检验目的基因是否表达出了蛋白质达出了蛋白质

11、个体生物学检验个体生物学检验个体生物学性状观察4141DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd4242检测是否插入检测是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的基因，目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因D

12、NADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质。抗体与蛋白质进行。抗体与蛋白质进行抗原抗原抗体抗体杂交，看是否有杂交带。杂交，看是否有杂交带。还可以进行还可以进行个体水平个体水平的鉴定，根据其的鉴定，根据其性状性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术首先提取受体细胞中的首先提取受体细胞中的DNADNA，然后高温解成，然后高温解成单链，再与同位素标记的单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗体杂交抗原抗体杂交所用到的

13、抗体是用表达出的蛋白质注射动物所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。4343大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。保留有表达产物的进一步培养、

14、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物4444 基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译45451.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是2、下

15、列属于获取目的基因的方法的是利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.46463.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4. 有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料47474848例、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血

16、因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等 于凝血因子氨基酸数目的3倍B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组 DNA分子导入羊的受精卵C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细 胞，而不存在于其他细胞中D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分 子的一条链为模板合成mRNA4949 尝试设计尝试设计 50501.答：答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基

17、因等。必须构建上述元件的主要理由是：因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，

18、如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。（P15）51512.解析：解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不

19、完全统计，约有菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属属643种种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。子叶植物也有侵染能力。 根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为

20、引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上质粒上Vir

21、区（毒性区）基因的诱导物，使区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。的加工和转移，从而侵染植物细胞。5252 需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。 如果

22、想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，区（诱导）的基因，使使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。53533.解析：解析：有

23、些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。生产这种糖蛋白是不可能的。54544.解析：解析：基本操作如下：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动前接上在大肠杆菌中可以

24、适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集珠蛋白基因的大肠

25、杆菌，收集菌体，破碎后从中提取菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。5555基因文库的分类按照外源按照外源DNADNA片段的来源：片段的来源：u从特定组织提取的染色体基因组从特定组织提取的染色体基因组DNADNA - -基因组基因组DNADNA文库文库（总）（总）umRNAmRNA反转录成的反转录成的cDNAcDNA拷贝拷贝-cDNAcDNA文库文库（部分）（部分）基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。下，便于获得所需的目的基因。5656基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库5757533555延伸延伸25858PCRPCR技

26、术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成 。 b b、复性（复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部 。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的 。 氢键单链DNA双链DNA链5959目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 检测检测: : 是否插入目的基因是否插入

27、目的基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译 鉴定鉴定: : 功能活性鉴定功能活性鉴定 抗性鉴定抗性鉴定6060DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd6161检测是否插入检测是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的基因，目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交