第九章：基因敲除与药学+张敏

1、第九章：基因敲除与药学 基因敲除技术与诺贝尔奖基因敲除技术与诺贝尔奖三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了科学家分享了20072007年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的学的Marie Marie CapecchiCapecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithiesOliver smithies教教授以及英国加蒂夫大学的授以及英国加蒂夫大学的Martin EvansMartin Evans

2、教授教授 基因敲除简介基因敲除简介定义定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1234567123456790890RNAi同源重组同源重组插入突变插入突变基因敲除（基因敲除（gene knock-outgene knock-out）通常所说到的基因敲除，又称通常所说到的基因敲除，又称基因打靶基因打靶，通过外源，通过外源DNADNA与染色体与染色体DNADNA之间的同源重之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和组，进行精确的定点修饰和基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因

3、的缺失或失活。基因的缺失或失活。应用应用DNADNA同源重组原理进行基因敲除同源重组原理进行基因敲除同源重组同源重组插入突变插入突变RNAi同源重组同源重组插入突变插入突变发生在同源序列发生在同源序列间的重组称为间的重组称为同源重同源重组组 ( h o m o l o g o u s ( h o m o l o g o u s recombination)recombination)，又又称基本重组称基本重组。是最基。是最基本的本的DNADNA重组方式，重组方式，通过链的断裂和再连通过链的断裂和再连接，在两个接，在两个DNADNA分子分子同源序列间进行单链同源序列间进行单链或双链片段的交换。或

4、双链片段的交换。 1.1.要有将外援基因导入宿主细胞的载体要有将外援基因导入宿主细胞的载体2.2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）基因敲除的必备条件基因敲除的必备条件基因敲除载体基因敲除载体通常，我们将外源基因通常，我们将外源基因DNADNA片段通过相应载体导片段通过相应载体导入入ESES细胞中，一个好的载体应具备以下特点：细胞中，一个好的载体应具备以下特点：1.1.能在宿主细胞中稳定存在能在宿主细胞中稳定存在2.2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即 multiple cloning multiple cl

5、oning site(MCSsite(MCS),),便于外源基因便于外源基因的插入。常用质粒。的插入。常用质粒。3.3. 具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ESES细胞进行筛选。细胞进行筛选。 常用的筛选标记为正负筛选：常用的筛选标记为正负筛选：NeoNeo（新霉素（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-HSV-tktk（单（单纯袍子病毒纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。NeoNeo新霉素基因阳性的新霉素基因阳性的ESES细胞可以再含有细胞可以再含有G418G418（一种

6、新（一种新霉素的类似物）的培养基上生长。霉素的类似物）的培养基上生长。HSV-HSV-tktk基因阳性的基因阳性的ESES细胞，编码的基因产物可以将更细胞，编码的基因产物可以将更昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。胚胎干细胞（简称胚胎干细胞（简称ESES细胞）细胞）胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞，胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞，具有体外培具有体外培养养无限增殖无限增殖、自我更新、自我更新和多向分化和多向分化的特性。的特性。（1 1）基因敲除载体的）基因敲除载体的构建构建Step1. Step1. 获得目的基因（待敲获得目的基因（待敲除基因）

7、的同源片段，将此除基因）的同源片段，将此DNADNA片段克隆到一般质粒中；片段克隆到一般质粒中；Step 2. Step 2. 从重组质粒中切除目从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的留部分序列在线性质粒载体的两端；两端；Step 3. Step 3. 将将neoneo基因和基因和HSV-HSV-tktk克隆到质粒中；克隆到质粒中；基因敲除的基本程序 根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种：不同，基因载体通常分为两种： 1 1插入性载体插入性载体(gene-in

8、sertion vector) (gene-insertion vector) 2 2置换型载体置换型载体(gene-replacement vector) (gene-replacement vector) 大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。（2 2）基因敲除载体导入）基因敲除载体导入ESES细胞细胞 将基因敲除载体导入将基因敲除载体导入ESES细胞，以载体上的细胞，以载体上的neoneo基因置换基因置换ESES细胞基因细胞基因组的

9、目的基因，从而得到组的目的基因，从而得到 基因敲除细胞基因敲除细胞 基因敲除载体导入基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔的方法有显微注射法，电穿孔法，法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等载体法等 1.正负双向筛选系统（正负双向筛选系统（PNS）：）： Nero基因表达，基因表达，ES细胞抗新霉素，在细胞抗新霉素，在G418的培养的培养基中存活。基中存活。 HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细细胞被杀死。胞被杀死。 （3 3）常用的筛选方法有两类）常用的筛选方法有两类 2.正向

10、筛选正向筛选 又称标记基因的特异性表达法，仅有又称标记基因的特异性表达法，仅有正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏自身的某个表达调控序列。自身的某个表达调控序列。 标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达。 可以分为无启动子筛选法，可以分为无启动子筛选法， 无增强子筛选法，无增强子筛选法， 无无poly（A）筛选法。）筛选法。 （2 2）常用的筛选方法有两类）常用的筛选方法有两类 3 3物理筛选方法物理筛选方法 主要是主要是PCRPCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。筛选方法，优点是灵

11、敏，专一性强；。 此外还有富集或筛选率比较高时，可以用此外还有富集或筛选率比较高时，可以用Southern Southern blotblot杂交法，杂交法， （2 2）常用的筛选方法有两类）常用的筛选方法有两类 （3 3）基因敲除的）基因敲除的ESES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡（4 4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 导入动物胚胎后，导入动物胚胎后，可以发育成嵌合子或完可以发育成嵌合子或完全全ESES来源的动物。来源的动物。嵌合体动物与正常的动嵌合体动物与正常的动物杂交，子代动物再杂物杂交，子代动物再杂交，有可能产生杂合型交，有可能产生杂合型突变体。突变体。（5 5）嵌

12、合体的杂交育种）嵌合体的杂交育种得到纯合体得到纯合体： 由于同源重组常常发由于同源重组常常发生在一对染色体上中生在一对染色体上中一条染色体中一条染色体中, ,所以所以如果要得到稳定遗传如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两型，需要进行至少两代遗传。代遗传。一、一、条件性基因敲除法条件性基因敲除法： 将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。 在传统基因敲除的基础上，利用了特异性重组酶系统作为在传统基因敲除的基础上，利用了特异性

13、重组酶系统作为调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。与与Cre-loxp重组酶系统有关。重组酶系统有关。第三节：基因敲除 进展及前景： 条件性条件性基因敲除优点基因敲除优点： 目标目标基因的敲除可以限定在特定的组织、基因的敲除可以限定在特定的组织、细胞或发育的特定阶段细胞或发育的特定阶段； 可避免因基因突变而致死胎的问题：可避免因基因突变而致死胎的问题： 在在2 2 个个loxP loxP 位点之间的重组率较高；位点之间的重组率较高； 如用病毒或配体如用病毒或配体DNA DNA 复合物等基因转移复合物等基因转移系统来介导系统来介导Cre Cre 的表达

14、，则可省去建立携带的表达，则可省去建立携带CreCre的的转基因动物的过程。转基因动物的过程。 常见的几种诱导性类型如下：常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。 二、体细胞基因敲除二、体细胞基因敲除伴随核移植和体细胞克隆技术的发展，体细胞基因敲除伴随核移植和体细胞克隆技术的发展，体细胞基因敲除-核移植核移植体系为研究热点。体系为研究热点。选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端粒酶基因的粒酶基因的DNA转染细胞，提高细胞的寿命和活力。

15、转染细胞，提高细胞的寿命和活力。三、基因捕获三、基因捕获 又称随机基因敲除，又称随机基因敲除，是随机插入又称随机基因敲除，又称随机基因敲除，是随机插入突变进行基因敲除的一种新型方法。突变进行基因敲除的一种新型方法。原理：原理： 将外源基因（报告基因、标记基因）的载体通过电穿将外源基因（报告基因、标记基因）的载体通过电穿孔或逆转录病毒载体法导入孔或逆转录病毒载体法导入ESES细胞，并随机整合到细胞基细胞，并随机整合到细胞基因组中，建立一个携带随机插入突变的因组中，建立一个携带随机插入突变的ESES细胞库。细胞库。 基因诱捕所用的载体一般由基因诱捕所用的载体一般由报告基因、选择性标记基因报告基因、

16、选择性标记基因及辅助元件及辅助元件组成。组成。 报告基因缺乏自身的某个表达调控序列，在捕获内源基报告基因缺乏自身的某个表达调控序列，在捕获内源基因的相应表达序列后获得表达。因的相应表达序列后获得表达。 根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义的基因诱捕包根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义的基因诱捕包括：括： 增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、poly（A）诱捕。）诱捕。 基因诱捕的优点基因诱捕的优点 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工库，节省大量筛选

17、染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。 基因诱捕的缺点基因诱捕的缺点 无法对基因进行精细的遗传修饰，无法对基因进行精细的遗传修饰， 四、四、RNAi引起的基因敲除引起的基因敲除 、：双链、：双链RNARNA进入细胞后，能够进入细胞后，能够在在DicerDicer酶的作用酶的作用下被裂解成下被裂解成siRNAsiRNA，并在并在RdRPRdRP（以（以RNARNA为模板指导为模板指导RNARNA合合成的聚合酶成的聚合酶RNARNA）的作用下自身扩增的作用下自身扩增后，再被后，再被DicerDicer

18、酶酶裂解成裂解成siRNAsiRNA。RNAi引起的基因敲除引起的基因敲除 ：SiRNASiRNA的双链解开的双链解开变成单链，并和某变成单链，并和某些蛋白形成复合物些蛋白形成复合物RNAi引起的基因敲除引起的基因敲除：上述复合物同与互：上述复合物同与互补的补的mRNAmRNA结合，促结合，促进进mRNAmRNA被被RNARNA酶裂解，酶裂解，并且以并且以SiRNASiRNA作为引作为引物，以物，以mRNAmRNA为模板，为模板，在在RdRPRdRP作用下合成作用下合成出出mRNAmRNA的互补链，的互补链，并在并在DicerDicer酶的作用酶的作用下也被裂解成下也被裂解成siRNAsiRN

19、A。RNAi引起的基因敲除引起的基因敲除：这些新生成的：这些新生成的siRNAsiRNA也也具有诱发具有诱发RNAiRNAi的作用，通的作用，通过这个聚合酶链式反应，过这个聚合酶链式反应，细胞内的细胞内的siRNAsiRNA大大增加，大大增加，显著增加了对基因表达的显著增加了对基因表达的抑制。抑制。五、基因敲除的应用1.1.基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生命科学理论问题的重要工具。命科学理论问题的重要工具。2 2建立生物模型。建立生物模型。 基因敲除技术就常常用于建立某种特定基基因敲除技术就常常用于建立某种特定基 因缺失的生因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。报道。3.3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗