分子标记技术简介样本

1、分子标记技术简介分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DN冰平 遗传多态性的直接的反映。 与其它几种遗传标记形态学标记、 生物化学标记、 细 胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的 性状的选择十分便利 ; 基因组变异极其丰富 , 分子标记的数量几乎是无限的 ; 在生 物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA勺变 异; 表现为中性 , 不影响目标性状的表示 , 与不良性状无连锁 ; 检测手段简单、 迅 速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗 传育种、 基因组作图、

2、 基因定位、 物种亲缘关系鉴别、 基因库构建、 基因克隆 等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的 DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的 特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求 ： (1) 具有高的多态性 ； (2) 共显性遗传 , 即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型 ； (3) 能明确辨别等位基因 ； (4) 遍布整个基因组 ； (5) 除特殊位点的标记外 , 要求分子标记均匀分布于整个基因组 ； (6) 选择中性(即无基因多效性 )； (7) 检测手段简单、 快速(如实验程序易自动化 )； (

3、8) 开发成本和使用成本尽量低廉 ； (9) 在实验室内和实验室间重复性好 (便于数据 交换)。可是, 当前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子, 然 后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交 , 经过放射自显影或非同位素显色技术来 揭示 DNA 的多态性。 限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以

4、DN/ DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶 识别并切割不同生物个体的基因组 DNA,得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数 目和各个片段的长度反映了 DNA分子上不同酶切位点的分布情况。经过凝胶电泳分析 这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即 获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后 产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、 重排、 缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。RFLP的等位基因其有共显性特点。R

5、FLP标记位点数量不受限制，一般可检测到 的基因座位数为1 4个。RFLP技术也存在一些缺陷,主要是克隆可表现基因组 DNA 多态性的探针较为困难 ; 另外, 实验操作较繁锁 , 检测周期长, 成本费用也很高。 自 RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、 疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。 数目可变串联重复多态性 (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR ) 数目可变串联重复序列又称小卫星 DNA (Minisatellite DNA), 是一种重复 DNA 小序列,为10到几百核苷酸,拷贝数10 一 10001不等。VNT

6、F基本原理与RFLP大致 相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必 须不在重复序列中 , 以保证小卫星或微卫星序列的完整性。 (2) 内切酶在基因组的其 它部位有较多酶切位点 , 则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列 , 经过电泳可 充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必 须是小卫星序列或微卫星序列 , 经过分子杂交和放射自显影后 , 就可一次性检测到 众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。小卫星标记的多态信息含量较高 , 在17一19之间。缺点是数量有限 , 而且在基 因组上分布不均匀，这就极大

7、限制其在基因定位中的应用。VNTF也存在实验操作繁 琐、 检测时间长、 成本高的缺点。二、基于PCR技术的分子标记技术(一)、随机引物的PCR标记所用引物的核苷酸序列是随机的 , 其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物 PCR 扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱 基序列的突变 , 不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段 大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。 随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD )RAP技术是1990年由Wiliam和Welsh

8、等人利用PCF技术发展的检测DNA多态性 的方法。基本原理：它是利用随机引物(一般为8 10bp)经过PCR反应非定点扩增 DNA片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物 DN/片段的多态性。扩增片段多态性便反映 了基因组相应区域的DNA多态性。RAP所使用的引物各不相同，但对任一特定引物, 它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DAh片段插 人、 缺失或碱基突变 , 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化 , 从而导致扩 增产物数量和大小发生改变 , 表现出多态性。 就单一引物而言 , 其只能检测基因组特 定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因

9、组 ，因此， RAPE用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱。与RFLP相比,RAPD具有以下优点：(1)技术简单,检测速度快；RAPD分析 只需少量DNA样品;(3)不依赖于种属特异性和基因组结构,一套引物可用于不同生 物基因组分析；(4)成本较低。但RAPD也存在一些缺点：(1) RAPD标记是一个显性标 记, 不能鉴别杂合子和纯合子 ; (2) 存在共迁移问题 , 凝胶电泳只能分开不同长度 DNA片段,而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3) RAP取术中影响因素很多 , 因此实验的稳定性和重复性差。 任意引物 PCR (Arbitrari

10、ly Primed Polymerase Chain Reaction,APPCR)在AP-PCR分析中,所使用的引物较长(10 50 bp) , PCR 反应分为两个阶段, 首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板 DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定 模板与引物之间相互作用。 然后进行高严谨退火条件的循环 , 两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。 采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物,最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退 火条件下能减少引物产生人为产物,应用成对组合的引物能够产生新的 AP-PC R谱 带, 但引物配对组合使用时

11、 , 得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不 相同, 这样, 50 个引物能产生 1250种不同指纹图谱。AP-PCF方法不需预知序列资料,而且检测的基因组样本是任意的,还能够用于 检测近等基因系(或同类系)中的多态性。AP-PCF的缺点是每个新的多态性都必须经 纯化才能进一步使用。另外 , 此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。 DNAT增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting, DAF)DAF是一种改进的RAP分析技术，与RAP技术不同的是，DAF分析中所使用的 引物浓度更高,长度更短(一般为5 一 8 bp),因此它所提供的谱带信息比 RAP*得

12、 多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一 100个DNA 片段。PCF扩增产物是在凝胶上进行分离，经过银染即可产生非常复杂带型。(二)、特异引物的PCF标记特异引物的PCF标记所用引物是针对已知序列的 DNA区段而设计的，具有特定 核苷酸序列(一般为18 24 bp),可在常规PCF复性温度下进行扩增，对基因组 DNA的特定区域进行多态性分析。 序列标志位点 (Sequence Tagged Sites, STS)STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。经过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特 定

13、区域，分析其多态性。利用特异PCF技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不 像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。 简单重复序列 (Simple Sequence Repeat, SSR)简单重复序(SSR)也称微卫星DNA,其串联重复的核心序列为1 一 6 bp,其中最 常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重 复单位数目10 一 60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 SSRfc记的基本 原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，经过PCRz应扩增微卫星片段，由于 核心序列串联重复数目不同,因而能够用PCM方法扩增出不同长度的PCR产

14、物，将 扩增产物进行凝胶电泳 , 根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSF具有以下一些优点：(I) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微 卫星呈共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然,在采用SSR 技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的 DNA序列的信息。如不能直接 从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 序列特异性扩增区 (Sequencecharacterized AmpIified Region, SCAR)SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCARS记是将目标RAPD片段进行 克隆并对其末端测序 , 根据 R

15、APD 片段两端序列设计特异引物 , 对基因 DNA 片段再 进行PCR特异扩增,把与原RAPE片段相对应的单一位点鉴别出来。SCARS记是共显 性遗传，待检DNA间的差异可直接经过有无扩增产物来显示。SCARS记方便、快捷、 可靠, 能够快速检测大量个体 , 结果稳定性好 , 重现性高。 单引物扩增反应 (SingIe Primer AmpIificatipn Reawtion, SPAR)SPAF技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用的 引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与 SSR之间的间隔序列进行特异性结合， 然后经过P(: R技术扩增SSR之间的D

16、NA序列，凝胶电泳分离扩增产物,分析其多态 性。另外,还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术,即ISTR ( In verse Sequencetagged Repeat) 技术, ISTR 所用的引物是在反向重复序列基础上设计的 , PCRT增的是反向重复序列之间的 DIVA序列。 DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异,在非变性聚丙 烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA勾象分析对DNA序列的改变非常敏感， 常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP

17、分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA 中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DN/分开成单链，再用非变性聚丙 烯酞胺凝胶电泳分离,根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP吉果 判定是经过多个样品之间对比 , 观察条带之间位置改变 , 从而显示出不同生物个体 的DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP勺检出率,可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析 (Heterocluplex analysis, Het) 法结合能够大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或 RNA进行杂交,含 有一对碱基对错配的杂交链能够和完全互补的杂

18、交链在非变性PAG®胶上经过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSC嗣Het分析能够使点突变的检出率接近100%,而 且实验简便。 双脱氧化指纹法 (Dideoxy Fingerprints, ddF )ddF是将双脱氧末端终止测序法与 SSCP吉合起来的分析技术,对由双脱氧末端 终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大 于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统 , 对于每一个突有多 次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了 SSCP分析时因 DNA长度影响SSCP显示的困难，经过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单

19、链 DNA,使其 中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。三、基于限制性酶切和PCF技术的DNA标记 扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP )AFLP是 1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测 DN A多态性的新 方法。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解 基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段, 再使双链人工接头的酶切片段相边接 , 作 为扩增反应的模板 DNA, 然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增 , 最后在接头 互补链的基础上添加 1 3个选择性核

20、苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩 增，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的 DNAT增片段，根据扩增片段长度的不 同检测出多态性。引物由三部分组成 : 与人工接头互补的核心碱基序列、 限制性内 切酶识别序列、引物 3'端的选择碱基序列 ( 110 bp) 。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。 该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行 PCR扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用 两个限制性内切酶 , 一个酶为多切点 , 另一个酶切点数较少 , 因而 AFLP 分析产生 的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP结合了

21、 RFLP和RAPD两种技术的优点，具 有分辨率高、 稳定性好、 效率高的优点。但它的技术费用昂贵 , 对 DNA 的纯度和 内切酶的质量要求很高。 尽管 AFLP 技术诞生时间较短 , 但可称之为分子标记技术的 又一次重大突破 , 被认为是当前一种十分理想、 有效的分子标记。 酶切扩增多态性序列 (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS)CAPS技术又称为PCRFLP,它实质上是PCF技术与RFLF技术结合的一种方法。 CAPS勺基本原理是利用己知位点的 DNA序列资源设计出一套特异性的 PCFgl物 (19 27bp),然后用这些引物扩增该位点上的某一 DNA片段,接着用一种专一性的 限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶