第三章-蛋白生物化学质化学--刘博整理

1、精品文档第三章蛋白质化学第一节 导 言一、概念蛋白质（protein ,简写pro）:是由20种L- a-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。二、蛋白质的元素组成：C、 H、 O、 N 及少量的S、 P 特点： N 在各种蛋白质中的平均含量为16%用定氮法可测定蛋白质含量：蛋白质含量（g）=蛋白质含氮量X 6.25蛋白质含量的测定：凯氏定氮法（测定氮的经典方法）优点：对原料无选择性，仪器、方法简单；缺点：易将非蛋白氮（如核酸中的氮）都归入蛋白质中,不够精确。样品含氮量平均在16% ，取其倒数100/16=6.25 ，即为蛋白质换算系数，其含

2、义是样品中每存在 1g 元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质） 。故：X 蛋白质含量=氮含量X 6.25三、 蛋白质的分类（一）按蛋白质的分子组成分类1. 单纯蛋白质：完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7 类：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80% 的乙醇） 、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强酸）。2.结合蛋白质：由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7 类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄

3、素蛋白和金属蛋白。8（二）按蛋白质的生物学功能分类1 . 催化蛋白：生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。2 .结构蛋白：蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4 ；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3 .运输蛋白：脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。四、蛋白质的生物学功能1 . 催化

4、功能：生物体内的酶几乎都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。2 .结构功能：蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4 ；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3 .运输功能：脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。4 .贮存功能：某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类

5、蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将多余的铁储存起来，供缺铁时使用。5 .运动功能：肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。6 .防御功能：高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。7 .调节功能：某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。8 .感觉功能：生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如，

6、 感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质。视杆细胞中的视紫红质，只需1 个光子即可被激发，产生视觉。9 .遗传调控功能：遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA 在在染色体中是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。B半乳糖甘酶基因的表达受到阻遏蛋白的抑制。10 . 其他功能：某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。第二节 蛋白质的基本单位氨基酸一、蛋白质的水解1 . 酸水解：常用6mol/L HCl 回流 20h ，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。2 .碱水解：水解完全，

7、会引起消旋，但色氨酸不破坏。3 .酶水解：水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破坏，主要用于蛋白质的部分水解。二、氨基酸的结构特征和分类氨基酸（amino acid,简写aa）：蛋白质的基本组成单位，是含氨基的竣酸。天然蛋白质由20 种氨基酸组成。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。氨基酸是具有氨基（-NH3+ ）或亚氨基和羧基（-COOH ）的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20 种，其通式为：1 . 氨基酸的结构特点（1）与竣基相邻的a -碳原子上都有一个氨基，因而称为a -氨基酸（2）除甘氨酸外，其它所有氨基酸分子中的a -碳原子都为不对称碳原子，所以： A. 氨基酸（

8、除Gly 外 ）都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有 D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。2 .氨基酸的分类1） 根据R 的化学结构（ 1 ） 脂肪族氨基酸：Ala、 Val、 Leu 、 Ile、 Gly 、 Met 、 Cys、Arg 、 Lys 、 Asp 、 Glu 、Asn 、 Gln 、 Ser 、 Thr（ 2）芳香族氨基酸：Phe、 Tyr、 Trp（ 3）杂环氨基酸：His 、 Pro2） 根据R 的极性（pH7 ）（ 1 ）极性氨基酸：1 ）不带电：Gly、Ser、 Thr、 Asn、 Gln、 Tyr、 Cys； 2）带正电：His、 L

9、ys、 Arg ；3 ）带负电：Asp 、 Glu（ 2）非极性氨基酸：Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Phe、 Met 、 Pro、 Trp1 . 按化学结构分为脂肪族、芳香族和杂环族三类。这种分类方法对于研究氨基酸的合成与分解有重要意义。2 .按R-基的极性分为非极性 R-基氨基酸、不带电荷的极性R-基氨基酸、带正电荷的极性R-基氨基酸、带负电荷的极性R-基氨基酸四类。这种分类方法对于研究氨基酸在蛋白质空间结构中的作用，和对于氨基酸的分离纯化均有重要意义。3 .也可将氨基酸分为非极性脂肪族R-基氨基酸、非极性芳香族 R-基氨基酸、不带电荷的极性R-基氨基酸、带正电荷的极性 R-基氨

10、基酸、带负电荷的极性 R-基氨基酸五类（二 ） 非蛋白质氨基酸二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号据 R 基团化学结构分类脂肪族A A （中性、含羟基或琉基、酸性、碱性）杂环 A A （His、Pro）随意编辑芳香族 A A（Phe、Tyr、Trp）据 R 基团极性分类非极性R基团AA （8种）极性R基团AA :不带电荷（7种）带电荷：正电荷（3种）负电荷（2种）据营养学分类：必需AA： Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His非必需A A据酸碱性质（氨基、羧基数）分类一氨基一竣基A A二氨基一竣基A A （Lys、His、Arg）一氨基二竣基A

11、A （Glu、Asp）三、氨基酸的性质（一）氨基酸的一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异溶解性： 各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机 溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200 以上。味感： 其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（ - ）表示，右旋者用（+ ）表示。各种氨基酸有其特定的比旋光度。可用作定性定量分析，是重要的物理常数。光吸收：构成蛋白质的20 种氨

12、基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区（<220nm） 均有光吸收。在近紫外区（220-300nm） 只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。Tyr、 Trp 、Phe在近紫外光区的最大吸收峰（入max）。酪氨酸 lmax=275nm , 苯丙氨酸 lmax=257nm , 色氨酸 lmax =280nm。（二 ）氨基酸的离解性质如果在某一pH 值下，氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等，即净电荷为零，则称该 pH 值为该氨基酸的等电点（pI）。各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的pI 在微酸性；碱性氨基酸的pI 在碱性 pH范围；酸性氨基酸的pI 在酸性 pH 范围

13、。氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。pH < pI, 样品带正电荷，样品点向阴极移动pH > pI, 样品带负电荷，样品点向阳极移动pH = pI, 样品不带电荷，样品点不移动氨基酸等电点的确定：可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK'值之和的二分之一.公式(三)氨基酸的化学性质1 . a-氨基参与的反应(1)与亚硝酸反应用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应。(2)与甲醛发生羟甲基化反应 用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度。(3)酰化反应 用途：用于合成多肽时保护氨基以及肽链的氨基端测定等。二硝基氟苯(DNFB

14、)法Sange法* 2,4二硝基氯笨在碱性条件下，能够与肽链 N端的游高一氨基作用，生成二硝基茶桁生物(DNP). 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨坂酸.该产物能够 用乙醍抽提分离.不同的DNP-氨基酸可以用色语法进行婆定.8EH基op-Wfrj生物HjO丹横既就法在碱性条件下，丹磺酰氮（二甲氨基茶磺酰氯）可以与 端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨表酸.此法的优点是丹磺酰氨基酸有很强的荧光性质，检测灵 敏度可以达到1 x 10-9moLEdman氨基酸顺序分析法 Edman （苯异硫鼠酸酯法）氨基酸顺序分析法实际 上也是一种N-端分析法.此法的特点是能够不断重 复循环，将肽链N-端氨基酸

15、残基逐一进行标记和解 离.2 .a-埃基参与的反应（1）成盐反应，而重金属盐则不溶于水氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水(2)形成酯的反应 用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体1(3)科茸法此法是多肽链C -端氨基酸分析法5多肽与腓在无水条件下 加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的羲基酸则 变成肝化物.肝化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质 而与C -端氨基酸分离.R oRji40Rn OI tiI III |聆01_(：卬««1101-1好一E011；冷端氨基酸c端氨基酸+R 0Rn OH ,IIII II± H+N-CH-C-NH

16、NK +氮基酸酰腓C 一端氨基酸3 . a-氨基和竣基共同参与的反应应反酮三甫用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。反应试齐1Millon反应Millon,硝酸，亚硝酸黄色反应HNO3 及 NH3乙醛酸反应乙醛酸H2SO4坂口反应次氯酸钠深酚，NaOHFolin酚试剂反应CuSO4磷鸨酸-铝酸5其他化学反应匕荧光胺的反应与5,4.呈色反应颜色反应基团红色酚基黄、橘更苯划、紫红呷咪红色月瓜基兰色酚基5'-双硫基-双(2-硝基苯甲第三节 肽、肽的概念 肽：一个氨基酸的a -竣基和另一个氨基酸的a -氨基脱水缩合而成的化合物。肽键：氨基酸之间脱水后形成的化学键称肽键（酰胺键）。肽链写法：游离a

17、 -氨基在左，游离a -竣基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N- 丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH Ser-Leu-Phe （ S-L-F）1 ）肽键具高度稳定性；2）具双键性质，不能自由转动；3 ）肽单元呈平面化和刚性性质；4） =C=O 与 =N-H 反式排列。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（10 个氨基酸残基以下）和多肽（多于10个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的a -氨基和a-竣基。氨基酸残基：在氨基酸缩合的反应中，每形成一个肽键即失去一分子水，相连的氨基酸成分被称为氨基酸残基。氨基酸残基的换算：自由氨基酸换算成氨基酸残基需减去一分子水。氨基末端羧基末端蛋白质与多

18、肽的区别：Peptide 空间构象不稳定，氨基酸残基数较少Protein 空间构象相对稳定，氨基酸残基数较多二、天然活性肽（一） 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。（二）激素肽和神经肽催产素和加压素：均为 9 肽， 第 3 位和第 8 位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。加压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。促 肾 上 腺 皮 质 激 素 （ ACTH ）：39 肽 ， 活 性 部 位 为 第 410 位 的Leu- 脑7Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly 。脑啡肽具有强

19、烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。Met- 脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu 。&内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用P-物质。是一种神经递质。（三）抗菌素肽短杆菌肽S第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次：1 . 一级结构：多肽链的氨基酸序列。2 .二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如a螺旋、B折叠等。3 .三级结构：球状蛋白质在二级结构基础上，借助次级键形成的相对独立的完整结构。4 .四级结构：具有三级结构的组成单位（亚基）之间的聚合方式。蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性

20、。如：20 种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为：2'1018又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假定在肽链的任一位置，12 种氨基酸出现的概率相等，则34000/120=28312（ 283 ） = 10（ 305 ）一、蛋白质的共价结构1. 一级结构的概念一级结构就是以肽键连接而成的肽链中的氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA 中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（ covalent bonds ）主要指肽键（peptide bond ）和二硫键（disulfide bond ） 。2

21、 .蛋白质分子中的化学键（ 1 ）氢键：羧基上的氧与亚氨基上的氢原子所形成。作用：链内维持二级结构；链间为三、四级结构所需。（ 2）疏水键：aa 非极性侧链形成。作用：维持三级结构。（ 3）盐键：即离子键带正负电荷的侧链通过静电引力形成。4）范德华力：中性分子或原子间的作用力。（ 5）酯键 ：羟基与羧基的缩合。（ 6）配位键：两个原子之间形成的共价键。共用电子对由一个原子提供.（ 7）二硫键：半胱氨酸氧化形成。（ 8）肽键：氨基酸之间脱水后形成的化学键称肽键（酰胺键）。维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键3 .蛋白质一级结构的测定（ 1 ）几种蛋白质的一级

22、结构（ 2）蛋白质一级结构测定 基本策略：片段重叠法要点： 测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分； 测定肽键的N末端（sanger,Edman,DNS 法、氨肽酶法）和C 末端（肌解法、竣肽酶法）； 断裂二硫键（琉基乙醇）； 应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用澳化鼠法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段； 分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序； 将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。N-末端分析A . DNFB 法 （与 2,4 一二硝基氟苯的反应） （ sanger 反应）B .氨基酸与苯

23、异硫鼠酯（PITC）的反应（Edman反应）C.丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基蔡磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到1 '10-9mol,比 DNFB 法灵敏 100 倍。D .氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N- 末端残基。C-末端的测定A.还原法：C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的a氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。

24、B.肌解法:多肽与肌在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除 C末端氨基酸外，其他氨基酸 都转变为相应的酰脏化合物。脏化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C 末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。C.竣肽酶法将蛋白质在pH 8.0, 30 c与竣肽酶一起保温，按一定时间问隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C 末端氨基酸的排列顺序。目前常用的竣肽酶有四种：A,B,C和Y; A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。竣肽酶 A 能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基

25、；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基 的肽键。通常将二者混合使用。竣肽酶 Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定 C末端氨基酸 外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。二硫键的断裂过甲酸氧化法巯基化合物还原法酶水解肽段氨 基 酸 顺 序A1Ala-Phe十肽顺序Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr-His-ValB1A2B2A3B3A4Ala-Phe-Gly-LysGly-Lys-Asn-TyrAsn-Tyr-ArgArg-TyrTyr-His-VaHis-Val二、 蛋白质的高级结构(一)蛋白质各级结构的基本概念一级结构 (primary structure) ：多肽链中氨

26、基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。二级结构(secondary structure ) ：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构。三级结构 (tertiary structure) ：多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使a -螺旋、B-折叠片、B -转角等二级结构相互配置而形成特定 的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。四级结构(quaternary structure ) :是指由两条或两条以上的相同或不同

27、的称作亚基( subunit )的亚单位通过非共价键聚合而成的蛋白质构象。均态四级结构相同亚基组成。非均态四级结构不同亚基组成。(二)构型与构象构型：不对称碳原子上的几个原子或基团的空间排布方式。改变须破坏共价键。构象： 在一个分子结构中一切原子沿共价单键转动时产生的不同空间排列。改变构象不涉及到 共价键。蛋白质的构象具有一定的稳定性 （三）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构（ secondary structure ） 指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有以下类型：1.

28、 a 螺旋（h helix ）要点：1 ）螺距一定每隔 3.6 个 AA 残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2 ）链内形成氢键螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧，链中的全部>C=0 和 >N-H 几乎都平行于螺旋轴; 每个氨基酸残基的>N-H 与前面第四个氨基酸残基的>C=0 形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。3 ）肽平面为基本结构单位: （ 1）键长键角一定；（ 2 ）原子排列为反式构型；（ 3）相邻肽平面构成两面角。4）右手a 螺旋。肽键中的C-N 键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。相邻的肽平面构成两面角。二面角：两相邻

29、肽平面之间，能以共同的 Ca为定点而旋转，绕Ca-N键旋转的角度称小角，绕C-C a键旋转的角度称山角。小和也称作二面角，亦称构象角。2.伊折叠结构（0-pleated sheet）是一种肽链相当伸展的结构。肽链接层排列，依靠相邻肽链上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。要点： 1 、伸展成折叠形式；2 、肽链呈锯齿状，R 基位于折叠角上并与棱角垂直；3 、链间形成氢键；4、氨基酸残基的轴心距为0.35nm 。5 、两种类型：平行式；反平行式。3. b-转角(b-turn)链内形成氢键，多肽链出现180 °的回折。此

30、回折角称日转角结构。 此结构 广泛存在球状蛋白中。4. 自由回转 (random coil) (亦称无规则卷曲、自由绕曲)指无规律的松散肽链结构。通常酶蛋白的功能部位在此。(四)超二级结构和结构域1 、超二级结构(super secondary structures) 指若干相邻二级结构单元组合彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体。此组合体为二级结构与三级结构间的一种过渡构象。如：aa, 0X0; BaB; M.。Rossmann 于 1973 年提出来的。2 、结构域(domains) ： 93多肽链在超二级结构基础上进一步缠绕盘旋折叠而成的紧密的相对独立的三维实体称结构

31、域。具有部分生物学功能。意义：动力学上更为合理；蛋白质(酶)活性部位常位于结构域之间，使其更具柔性。Wetlaufer 于 1973 年根据对蛋白质结构及折叠机制的研究结果提出了结构域的概念。结构域与三级结构的关系：多肽链二级结构超二级结构结构域三级结构(五)蛋白质三级结构概念：是整个多肽链的三维构象，它是在二级结构的基础上，多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构。较小蛋白质分子：多为单结构域，即三级结构；较大蛋白质分子：由2 或 2 个以上结构域结合成三级结构。肌红蛋白是1957年由John Kendrew 用X射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。它是典型的球形蛋白质，高度折叠

32、成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条a-螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的His 残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2 结合） 。蛋白质三级结构的构象特点：（ 1 ）三级结构构象近似球形。（ 2）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓“表面亲水，内核疏水”。（ 3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层，对蛋白质分子构象起到很好的保护作用。（ 4） 三级结构形成之后，分子表面有空穴,是结合底物,效应物等配体,行使

33、生物学功能的活性部位,空穴通常是一个疏水的区域。（六）蛋白质的四级结构具有独立三级结构的多肽链彼此通过非共价键相互连接而形成的具有特定构象的聚合体结构就是蛋白质的四级结构（quaternary structure ） 。亚基： 几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，每条肽链为蛋白质分子中的最小共价单位，这种肽链称为该蛋白质的亚基（subunit） 。单体和原体（p89 ）一种蛋白质中，亚基结构可以相同，也可不同。如烟草斑纹病毒的外壳蛋白是由2200 个相同的亚基形成的多聚体；正常人血红蛋白A是两个a亚基与两个B亚基形成的四聚体；天冬氨酸氨甲酰基转移酶由六个调节亚基与六个催化亚基组成。有人将

34、具有全套不同亚基的最小单位称为原体（protomer） ，如一个催化亚基与一个调节亚基结合成天冬氨酸氨甲酰基转移酶的原体。维系亚基间的作用力血红蛋白：2个a亚基和2个B亚基。 104小结：蛋白质的二级结构是指多肽链骨架盘绕折叠所形成的有规律性的结构。最基本的二级结构类型有a-螺旋结构和B-折叠结构，此外还有B -转角等。右手a -螺旋结构是最常见的二级结构，每圈螺旋含有3.6 个氨基酸残基，螺距为0.54nm ，螺旋中的每个肽键均参与氢键的形成以维持螺旋的稳定。形成肽平面B -折叠结构也是一种常见的二级结构，在此结构中，多肽链以较伸展的曲折形式存在，肽链 （或肽段）的排列可以有平行和反平行两种

35、方式。氨基酸之间的轴心距为0.35nm,相邻肽链之间借助氢键彼此连成片层结构。超二级结构是指蛋白质分子中的多肽链在三维折叠中形成有规则的三级结构聚集体。结构域是介于二级结构和三级结构之间的一种结构层次，是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域。蛋白质的三级结构是整个多肽链的三维构象，它是在二级结构的基础上，多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构。一般都是球蛋白，这类蛋白质的多肽链在三维空间中沿多个方向进行盘绕折叠，形成紧密的近似球形的结构，分子内部的空间只能容纳少数水分子，几乎所有的极性R 基都分布在分子表面，形成亲水的分子外壳，非极性的基团被埋在分子内部，不与水接触。蛋白质分子中侧

36、链R 基团的相互作用对稳定球状蛋白质的三级结构起着重要作用。蛋白质的四级结构指数条具有独立的三级结构的多肽链通过非共价键相互连接而成的聚合体结构。在具有四级结构的蛋白质中，每一条具有三级结构的肽链称为亚基或亚单位，缺少一个亚基或亚基单独存在都不具有活性。四级结构涉及亚基在整个分子中的空间排布以及亚基之间的相互关系。维持蛋白质空间结构的作用力主要是氢键、离子键、疏水作用力和范德华力等非共价键，又称次级键。此外，在某些蛋白质中还有二硫键，二硫键在维持蛋白质构象方面也起着重要作用。蛋白质的空间结构取决于它的一级结构，多肽链上的氨基酸排列顺序包含了形成复杂的三维结构（即正确的空间结构）所需要的全部信息

37、。第五节蛋白质分子结构与功能的关系一、蛋白质一级结构对高级结构的影响a-螺旋结构形成的限制因素：凡是有Pro存在的地方，不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻，则因pH=7.0时都带负电荷，防碍a螺旋的形成; 同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内，正电荷相斥，也防碍a螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍a螺旋的形成。二、蛋白质一级结构与生物功能1 . 比较生物化学不同种属的胰岛素的相同点作用相同：降低血糖分泌部位相同：胰脏的兰氏小岛b 细胞分子量：几乎完全一样结构：都由A、 B 两链组成，A 链 21 个氨基酸残基，B

38、链 30 个氨基酸残基;有 22 个 AA 残基始终相同，特别是6 个 Cys 的位置始终不变，故A、 B 两链的连接方式相同。不同点：主要差别在A 链的8、 9、 10 位和 B 链的 30 位 AA 残基；说明这些氨基酸对胰岛素的生物活性无决定作用。胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分亲缘关系越近，AA 同源性越大2 .蛋白质一级结构的变异与分子病分子病指蛋白质分子中由于AA 排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病（基因突变造成的）。镰刀形贫血病：病因：血红蛋白AA 顺序的细微变化镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄

39、，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。镰刀型贫血病血红蛋白仅一级结构：B 6Glu换成06Val由此引起三级结构多一 疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血。3 .蛋白质的激活胰岛素原与胰岛素（牛胰岛素原的激活）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂117三、蛋白质构象与功能的关系1 . 变构蛋白变构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因变构而产生的效应称变构效应。血红蛋白是变构蛋白，O2 结合到一个亚基上以后，影

40、响与其它亚基的相互作用2 .蛋白质的变性与复性构象的解体，会使蛋白质的活性丧失。第六节几种典型蛋白质的结构与功能一、纤维状蛋白质(fibrous protein)特点：不溶于水；在一定限度内伸长后还可复原；不易被蛋白酶水解；含有特殊的氨基酸。1 、纤维状蛋白质的类型不溶性：角蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白可溶性：肌球蛋白，纤维蛋白原(1)角蛋白：角蛋白中主要的是 a-角蛋白。a-角蛋白主要由a-螺旋构成的多肽链组成。一般是由三条右手a- 螺旋肽链形成一个原纤维(向左缠绕)，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性。 a- 角蛋白的伸缩性能很好，当a- 角蛋白被过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此

41、时a- 角蛋白转变成b- 折叠结构，称为b- 角蛋白。毛发的结构：一根毛发周围是一层鳞状细胞，中间为皮层细胞。皮层细胞横截面直径约为20mm 。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。(2)b- 角蛋白：丝心蛋白(fibroin) ：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式b- 折叠片， 多肽链取锯齿状折叠构象。3.胶原蛋白：胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm ，每一螺圈含3.3 个残基,每一残基沿轴向的距离为0.

42、29nm 。一级结构分析表明，a 肽链的 96% 都是按三联体的重复顺序：(g1y-x-y)n排列而成。Gly数目占残基总数的三分之一，x常为Pro , y常为Hpro(羟脯氨酸)和Hlys (羟赖氨酸）存在部位：是皮肤、肌键、软骨、巩膜、角膜的主要成分，占机体蛋白质总量的1/3 。结构要点：每条多肽链为a-左手螺旋，而非右手螺旋（二级结构）。三条a左手螺旋的多肽链右手超螺旋形成原胶原蛋白分子（三级结构）。 多个原胶原蛋白分子构成胶原蛋白分子（四级结构）二、球状蛋白质血红蛋白的结构与功能1 ）血红蛋白的结构特点：a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000 ;b. 是由相同的两

43、条a 链和两条b 链组成四聚体a2b2 ；c. a 链由 141 个 AA 残基组成，b 链由 146 个 AA 残基组成；四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。2 ）血红蛋白的功能：存在于动物血液的红细胞中，具有运输O2 和 CO2 的功能；血红蛋白还能和 H+ 结合，从而可以维持体内pH. 。H b 是通过其辅基血红素的Fe+ 与氧发生可逆结合的，血红素的铁原子共有6 个配位键，其中4个与血红素的叱咯环的N结合，一个与珠蛋白亚基F螺旋区的第8位组氨酸（F8）残基的咪唾基的 N 相连接，空着的一个配位键可与O2 可逆地结合，结合物称氧合血红蛋白。血红蛋白由四个亚基组成，

44、脱氧时， 四条链的C 端均参与盐键的形成，多个盐键的存在使它处于高度约束状态，当一个氧分子冲破阻力与血红蛋白的一个亚基结合后，这些盐键被打断，使亚基构象发生改变，进而引起邻近亚基的构象发生改变，这种变化易于和O2 的结合，并继续影响第三个和第四个亚基与 O2 的结合，表现为血红蛋白和氧的亲和力迅速增强，这种作用称为变构作用。这种作用又称为协同效应。由此Monod 提出了蛋白质的变构作用。3 .H+ 、 CO2 和 BPG 对血红蛋白结合氧的影响1914 年， C.Bohr 发现1 ） H+ 、 CO2 促进 O2 的释放 （Bohr 效应 ）定义：高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放

45、O2,而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2,血红蛋白对02、 H+和CO2结合的这种相互关系叫 波耳效应。134波耳效应的生理意义A:当血液流经组织，特别是代谢旺盛的组织如肌肉时，这里的pH较低，C02浓度较高，氧合血红蛋白释放 02，使组织获得更多02，供其需要，而02 的释放，又促使血红蛋白与H+与 C02 结合，以缓解 pH 降低引起的问题。B： 当血液流经肺时，肺 02 升高， 因此有利于血红蛋白与02 结合， 促进 H+ 与 C02 释放， C02的呼出又有利于氧合血红蛋白的生成。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉状纤维

46、沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉状纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、疯牛病等。三、糖蛋白概述定义：一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋白质。特点：蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。分布：细胞膜、溶酶体、细胞外液连接方式：N- 连接 0- 连接 139糖蛋白寡糖链的功能1. 对糖蛋白新生肽链的影响：:参与新生肽链的折叠并维持蛋白质的正确的空间构象；影响亚基聚合；糖蛋白在细胞内的分拣和投送。2. 对糖蛋白的生物活性的影响：保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期。3. 参与分子的识别作用4. 载体 四、脂蛋白血浆脂蛋白超速离心法：乳糜微粒，

47、极低密度脂蛋白，中间密度脂蛋白，低密度脂蛋白，脂蛋白，高密度脂蛋白功能：与脂质的亲和作用而使脂质溶于水性介质中。运转胆固醇和甘油三酯。作为脂蛋白外壳的结构成分，与脂蛋白外生物信息相联系。以配体的形式作为脂蛋白与特异受体的连接物。激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类。第七节 蛋白质的性质蛋白质的性质与其分子大小、结构及其组成氨基酸的性质密切相关。一、蛋白质的两性离解和等电点蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH 值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH 值即为该蛋白质的等电点（ pI ） 。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不

48、移动。在pH 低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在pH 高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳 这是带电粒子在电场中移动的现象。二、蛋白质相对分子质量的测定常用方法：超离心沉降速度法凝胶过滤层析法 化学分析方法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法凝胶过滤法：葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。 洗脱时大分了随洗脱液从颗粒间隙先洗脱；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，迟后洗脱下来。若用多种已知

49、相对分子质量的标准蛋白质准确测得各自的洗脱体积（Ve） ，以 Ve对相对分子质量对数作图，得标准曲线，再用同样条件测定未知样品洗脱体积（Ve） ，从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶过滤法可测定（1 80）万范围内的相对分子质量，误差为±5。但对变性蛋白和线性分子不适用。化学分析方法：公式例如，测得细胞色素c 的铁元素含量为0.43 ，已知铁相对原子质量为55.8 ，则最小相对分子质量（M）为：M =55.3 X100/0.43弋13000因为细胞色素c分子只有一个铁吓咻辅基，所以，计算结果与其他方法测得的真实相对分子质量相当。沉降系数S 的意义与应用：对蛋白质溶液进行5

50、 6 万 r/min 的超速离心，蛋白质分子会向离心池底部方向移动，离心池上面为清液，清液与下面的溶液之间出现一个界面。用光学方法测定界面移动的速度，即为蛋白质的离心沉降速度。根据下面的公式可求出溶质的沉降系数。公式S 沉降系数t离心时I可x界面移动距离 角速度沉降系数S 是文献中经常使用的物理量。其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。一个 S单位是1X10-13S ,相对分子质量越大，S越大。蛋白质的沉降系数大都在1 200S 之间。 当一种新发现的大分子，其结构、 性质和功能都处在研究过程中时，其名称未定，为了描述方便，常用其沉降系数S 来表示。SDS-PAGE 电泳法测

51、定分子量蛋白质在PAGE 中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、所带电荷的量以及分子形状。而SDS-PAGE 电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了十二烷基硫酸钠。SDS 是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS 后， SDS 与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合SDS 的蛋白质 -SDS 复合物的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成正比。这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小。三、蛋

52、白质胶体性质由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm 之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：1、蛋白质多肽链上含有许多极性基团， 形成水化膜。如：NH3+、-COO-、 OH、-SH、-CONH- 等，它们都具有高度的亲水性，当与水接触时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。蛋白质溶液由于具有水化层与双电

53、层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质胶体性质的应用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等四、蛋白质的沉淀蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。

54、（一）可逆沉淀定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH 或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。1 . 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。2 .弱酸或弱碱沉淀法（等电点沉淀）用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH 处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。1613 . 有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。（二）不可逆沉淀定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且