pMD19-T载体说明书

1、TaKaRa Code： D102ApMD®19-T VectorTaKaRa宝生物工程（大连）有限公司内容Page制品说明1制品内容1保存1纯度1用途1 pMD®19-T Vector的结构1实验操作2Control DNA片段的克隆实验2一般DNA片段的克隆实验2相关说明3使用注意4 Q&A制品说明pMD®19-T Vector*-种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用第体。本載体由pUC19«体改建而成, 在PUC19載体的多克騒位点处的加£ I和如I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用尿oR V进行肆切 反应民

2、再在两侧的3,靖激加“0而成.因大韶分咐热性DNAJR合8|进行PCR反应时都有在PCR严物 的3,末靖満加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR严物的连接、克隆效率由于本娥体以pUC19載体为基础构建而成，所以它具有同PUC19載体相同的功能.此外，本制品中的高 效连接液Solution I可以在短时闻内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细茵转化，大 大方便了实验操作.本制品中的Control Insert (500 bp)还可以用于Control反应.本載体与pMDF8T Vector相比，本创葩的P 半乳糖昔II的衰达活性更高，苗落昱示蓝色的时间缩短, 茵落显示

3、的蓝色更裸。因比，克隆后更容易进行克騒体的蓝白筛逸。制品内pMD®19-T Vector (50 ng/il)20plXl 支Control Insert (50 ng/2)10glxl 支Solution I*75P1X2 支*便用时谓于冰中融解。保存：20乜纯度 Control Insert经克隆后的白包菌落中，有90%以上含有Insert DNA R段用途进行TA克隆，克H&PCR严物。对克Ifc后的PCR严物使用BcaBEST Sequencing Primers M13 Primers进行DNA测序. pMD®19-T Vector的结构pMDs19-TV

4、ertor(2,692 bp)EcoR l Sue I Kpn Xma IT-Ctoning SiteI BamH I Xbal Econv Sall Acc I H/ncll Pstl Sso8387 I Sphl Hind 1118c«fiESTT- Sequencing Prtrror RV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGG Hine 11S朗 87 I ACC IHind ni PlL, FWIW fopR 匕心1Xmal5GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGOC-GCAGG

5、TCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTClcZ1#Digested by EcoA VACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTQGGAAAACCCTGGCO JCAGCACTGACCCmTGGGACCGC aGaBEST,M Sequencing Primer M13-47gtcgacgatTatetetaga. _ _, 小丄、cagctgc ta Ttagagatc t.(T-Cloning Site)#pMD®19-T Vector相关位点说明】Cloning 8辻 e431BcaBEST Sequencing

6、Primer M13-47 binding site352-375BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding s辻e484-507LacZ operator146-475ColEl ori873-1461Ampr1632-2492实验操作 Control DNA片段的克隆实验A）操作方法1）在微丘离心管中配制下列DNA濬戒，全为5皿。pMDr19-T Vector*l1plControl Insert*21pldH2032）加入 5 pl （等童）的 Solution I.3）16P反应30分钟.注）室温（259也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。5分钟

7、也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。4）全H （10 pl）加入至100MJM109燼受态细胞中，冰中SJt 30分伊5）42P加热45秒钟后，再在冰中放1分伊6）加入890plSOC培养基，379掘荡培养60分钟.7）在含有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板墳养基上培养，形成单苗落.计数白色、蓝色茵蒂。8）挑选白色苗落，使用PCR法确认栽体中插入斤段的长度大小。B）结果使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5X108 cfu/Mg pUC19 DNAoControl Insert连接/转化效本 (cfu/ pg Vector)白色

8、U落比卓（）效車(%) *+2.8 X10696.390以上2.2 X10540.20效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率.一般DNA片段的克隆实验1)在微畳离心管中配制下列DNA濬液，全为5 4 pMD®19-T Vector*l1 屮Insert DNA*30>1 pmol0.3 pmoldH2Oup to 5 pl2) 加入 5 pl (<Ht)的 Solution I。3) 169反应30分钟。注)室温(25也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低. 长片段PCR产物(2kbp以上)进行DNA

9、克隆时，连接反应时间谓延长至数小时。4) 釦t (10 pl)加入至100MJM109感受态细胞中，冰中放30分锹5) 42P加热45秒钟民 再在冰中放分钟.6) 加入890 pl SOC培养基，379振荡培养60分钟7) 在含有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板培养墓上培养，形成单菌落.计数白色、蓝色WS8) 挑选白色苗落，使用PCR法确认載体中插入片段的长度大小.1 pMD®19-T Vector的使用取0.5 pl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD®19-T Vector 1 |il (50 ng)的尔数约为 0.03 pm

10、ol«2 Control InsertControl Insert 为 500 bp 的 3,末端带有 A 被基的 PCR 产物，Control Insert 1 pl (50 ng)的豪 尔数约为0.15pmoL3 Insert DNA 的使用在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为4 : 240相关说明1. 感受态细胞的选择.转化时请使用高效的热转化赫受态细胞(转化效車A1X 108 cfu/pg PUC19),这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果潘要进行蓝白筛选时，宿主细18必須具有正确的羞因型(F'编码的严生3 Fragment,才可

11、能和假体DNA严生的a多狀相结合，表现出B 半乳糖昔酵活性(a 互补性)。2. Insert DNA 的要求Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行栽体连接，尽進免引物停其它奈质的存在。切胶回 收时可使用TaKaRa凝胶回收试剂盒(TaKaRa Code: D301威DV805A)。3. Insert DNA使用的计算方法进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的康尔数比一般为1: 210,我们可以根据自己的实验情况 选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用的计算方法如下：Insert DNA 的使用it (ng) =

12、nmol 数 X 660 X Insert DNA 的 bp 数本第体1 pl (50 ng)的廉尔数约为0.03 pmol.4. 阳性克隆的检測.DNA片段成功插入SpMD*19-T Vector*®, 一般情况下p 半乳昔障的衰达将受到破坏，重组克隆 体在禽有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板培养基上培养时将星尿白包苜落但有时比校短的DNAR段 插入載体时，塞因的读码桩有可能正好与"潮读码框相物合，克隆体也会显示蓝色茵落.有报道称，2 kbp的DNA片段插入到載体中后，重组克軽体仍显示了蓝色.所以，当我们没有得到白包菌落时，可以试 着检测蓝色WT落.进行阳性克隆检测

13、时，我们建议使用PCR的方法，扩増用引物可以使用BCaBEST Sequencing Primers,可以对菌体直接进行PCR扩増。5. 阳性对照卖验。为了确认实验it作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验.按照实验操作方法，使 用试剂盒中提供的Control Insert,可以进行10次阳性对照实验.6. 转化效車的计算。取01 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 pl的热转化感受态細胞中后，再加入900 pl的SOC培养基 （0.1 ng DNA/ml）,将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100皿涂布平板（0.001 ngDNA/

14、100 pl）,记录Wf落数.以得到200个克It体为例计算转化效率，此时的转化效車=200 cfu/0.001 ng=2 X105 cfu/ng=2 X 108 cfu/gg pUC19 DNA使用注意1. Solution I 请于冰中Mfto2. 克It时使用的Insert DNA H段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段 DNA （甚至是电泳也无法确认的非待异性小片段）、残存引物芳奈质都会影响TA克騒效車3. 按照*实验操作进行连接启，直接进行转化时的连接液不要超过20山当要转化的DNA量校大或 准备进行电转化时，希对连接液进行乙酵沉淀，纯化DNA唇再进行转化.

15、进行乙諄沉淀时使用核酸 共沉剂（TaKaRaCode: D605A）可以提高DNA的回收車。4. 连接反应请在259以下进行，温度升高（269）校难形成环状DNA.连接效車偏低时，可适当 延长连接反应时间至数小时。5. 本制冊来潭于PUC19載体，因此，适合PUC19«体的燼受态细胞祁可以使用，如：JM109等. Q&AQ-1怎样提商连接转化效車？A-1 1. Insert DNA R段的3'末靖是否帯有“A”尾.大部分的商保真DNA豪合降（如：哒a届 Pyrobest. KODx田、Pfu® 扩増的PCR严物是平滑末町不能直接进行TA克隆。2. 纯化PCR

16、严物.最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR严物中的非特异性片段和引物等 奈质。进行切胶回收时可以使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code: D301或DV805A）。3. 请使用转化效率大于108 cfu/g pUC19 DNA的感受态细胞。4. DNAR段的立体结枸、DNA片段的长短都会形响克彥效率一般悄况下，大片段DNA的克蛊 效車（连接效車与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，威釆用电转化方法.5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线时间过长.6. Solution I应尽童3!免反复冻融7建议使用新配制的平板墳养基Q-2转化后的菌落全为蓝色

17、，但有目的DNAR段的插入，为什么？A-2插入的DNAR段校短（小于500 bp）,且插入片段没有影响墓因的读根，比时平板培养墓上 出现的菌落有可能呈现蓝包（或淡蓝色）.Q-3欲对克R6DNA片段进行测序时，使用何种引物？A-3本載体未潭于PUC19裁体因就，用于PUC19載体測序的通用引物都可以使用.Q-4 pMD19-T Vector与pMD18T Vector比有何不同?A-4 pMDr19-T Vector与pMDF8T Vector比，p -半乳«f昔酵的表达活性更商，茵落显示蓝色的时间缩短，茵落显示的蓝色更棵.pMD*18T Vector连搂转化后，一般要经37P过夜培养，然后再将其于冰箱内放一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色.而PMD*19-T Vector涂板培养启一般只需10 个小时（37P）便可以呈色.因比，pMD19-T VectorttpMD*18-T VectorJEfiJK白菌落的筛逸MEMO-5-技术咨询热线 87641686800890950