《肽与蛋白质》备课材料1

1、肽与蛋白质备课材料杨 旭2000年9月3日于北京开始准备第一章：绪论（2学时）l 关于我们的教材和教学大纲- 本书蛋白质分子基础是高等教育出版社出版的大学教材。专供生化专业和分子生物学专业的本科学生使用。- 我们现在拿到手的是第二版第二次印刷本（1999年11月）。是目前国内可以找到的最新版本的该课教材。目前北京大学生化本科学生也在使用本教材。- 该教材由北京大学生命科学院茹炳根教授（国家教委任命的本书主审）亲自推荐，茹教授是我国“蛋白质与肽”领域的学科带头人。- 我们采用的教学大纲也是茹教授所编写的。一、 蛋白质的重要地位（pp1-1）l 组成生命的最基本的物质：水、蛋白质、核酸、脂肪、糖类

2、、无机盐。生物体是靠蛋白质来进行和完成生物功能的l 蛋白质和肽领的研究是生命科学的重要组成部分之一，是生命科学的前沿。人类基因组研究计划（Human Genome Project, HGP）以趋完成，后人类基因组研究计划将包括（谷志远，第173页）：- 基因克隆计划；- 基因组多样性计划；- cDNA（互补DNA）计划； 以上三项都是HPG计划的延伸- 蛋白质计划：从基因图谱转化出蛋白质一级结构（信息的-电脑；物质的-体外翻译），大规模地研究基因产物-蛋白质的种类、结构与功能；- 细胞计划：以信号传递为主线，阐明发生在细胞中的生命现象的奥秘。蛋白质计划、细胞计划则比前三项更具有开创性。二、 蛋

3、白质的组成（pp1-7）18l 氨基酸的结构通式：氨基酸的共同特点是：与羧基相邻的-碳原子都有一个氨基，故称-氨基酸，结构通式如下。各种氨基酸的区别在于侧链基团（R-基团）不同。l 氨基酸分类：- 构成蛋白质的氨基酸：共20种，都是L-构型的-氨基酸；- 氨基酸衍生物：共5种：L-胱氨酸、L-羟脯氨酸、L-羟赖氨酸、L-甲状腺素、锁链素；- 非蛋白质氨基酸：200多种，常见的如表1-4所示。l 按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的物理性质分类：见表1-1- 脂肪族类：甘氨酸G、丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、异亮氨酸I；- 羟基类：丝氨酸S、苏氨酸T；（OH）- 酸性氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E；（

4、2个羧基：COO）- 碱性氨基酸：组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R；（含氨基或胺基）- 酰胺类：天冬酰胺N、谷氨酰胺Q；（酰胺基）- 含硫类：半胱氨酸C、甲硫氨酸（蛋氨酸）M；（含硫）- 芳香族类：苯丙氨酸F、酪氨酸Y、色氨酸W；（含苯环）- 亚氨基酸：脯氨酸P（唯一不符合通式的氨基酸）。l 按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的疏水性分类：- 疏水氨基酸：丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、异亮氨酸I、甲硫氨酸M、脯氨酸P 、苯丙氨酸F、色氨酸W（gt 0.5）；- 强亲水氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E 、组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R（酸性碱性氨基酸）（gt < -2.5）。- 弱亲水氨基酸：所有其它氨

5、基酸（gt -0.3 0.4）。l 按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的带电荷情况分类：- 不带电荷：丝氨酸S、苏氨酸T 、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、半胱氨酸C、酪氨酸Y（羟基类、酰胺类等）；- 中性溶液带负电荷：天冬氨酸D、谷氨酸E（酸性氨基酸）；- 中性溶液带正电荷：组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R（碱性氨基酸）。三、 蛋白质的分类（pp7-8）l 按蛋白质化学组成分类：简单蛋白质、结合蛋白质l 简单蛋白质进一步分为七小类（根据溶解性质的不同）：- 清蛋白类（albumins）：又称为白蛋白，营养成份；- 球蛋白类（globulins）：例如：免疫球蛋白；- 组蛋白类（histones）；存在于染色

6、体中；- 精蛋白类（protamines）：存在于精子中；- 谷蛋白类（glutelins）：存在于禾本植物种子；- 醇溶蛋白类（prolamines）；溶于乙醇；- 硬蛋白类（scleroproteins）：角蛋白、胶原蛋白、丝心蛋白。l 结合蛋白质进一步分为七小类（根据非蛋白质成分的不同）：- 糖蛋白类（glycoproteins）：与糖类结合；- 核蛋白类（nucleoproteins）：与核酸结合；- 脂蛋白类（lipoproteins）：与脂类结合；- 磷蛋白类（phosphoproteins）：与磷酸共价结合的蛋白质；- 金属蛋白类（metalloproteins）：与金属离子直接

7、结合的蛋白质；- 血红素蛋白类（hemoproteins）：与血红素结合的蛋白质；- 黄素蛋白质（flavoproteins）：与黄素核苷酸结合的蛋白质。其他分类：按功能分类、按蛋白质空间结构分类。L-：是D-构型氨基酸的立体异构体，蛋白质中都是L-构型氨基酸（具有L旋光性）。-碳原子：联接氨基酸四个取代基（羧基、氨基、氢原子、侧链(R-)基团的碳原子。pK：解离常数。pI = 1/2 (pK1+pK2) ；pI：等电位点，蛋白质在溶液不向正或负极移动。四、蛋白质结构简介：肽键（peptide bond）：是一分子的氨基酸的-羧基与另一分子氨基酸的-氨基脱水缩合而成的酰胺键（-COOH + -

8、NH2 = -CO-NH- + H2O）。多肽链（polypeptide chain）、氨基末端（amino terminal）、羧基末端（carboxyl terminal）：许多氨基酸借助肽键连接成的长链称为多肽链。多肽链的两端的-氨基和-羧基都是游离的，一般将多肽链游离的-氨基（写在分子式左边）称为氨基末端或N端；游离的-羧基（写在分子式右边）称为羧基末端或C端。肽（peptide）、多肽（polypeptide）、蛋白质（protein）：由氨基酸脱水缩合的化合物称为肽（或称缩氨酸）；通常将10个以上氨基酸组成的肽称为多肽；分子量大于5000（约4050个氨基酸残基）且具有稳定的高级构

9、象（空间结构）的称为蛋白质。蛋白质分子的结构层次：一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构一级结构（primary structure）：又称化学结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，包括组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列两个重要方面。二级结构（secondary structure）：指的是多肽链主链骨架中若干肽段各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维持，从而形成有规律的构象（空间结构）。如-螺旋、-折叠、-转角等。超二级结构（super secondary structure）：指的是蛋白质分子中的一些二级结构单元，在空间进一步聚集、组合在一起，形成的一种

10、高于二级低于三级结构的新的空间层次。常见的超二级结构有、T、等。结构域（domain）：指的是由超二级结构形成的紧密、稳定，而且在蛋白质分子构象上明显可分的区域。一般由50-400个氨基酸组成，它们分别担负蛋白质分子的不同功能，是蛋白质分子的生物功能实体。三级结构（tertiary structure）：指的是一条多肽链在二级结构的基础上，由于其顺序相隔较远的氨基酸残基侧链的互相作用（氢键、疏水键、范德华力、离子键、配位键、二硫键），而进行范围广泛盘旋和折叠，从而产生特定的不规则的球状结构。四级结构（quarternary structure）：指的是各个亚基（亚单位）在多聚蛋白中的空间排布及

11、亚基的互相作用。第三章：蛋白质一级结构测定（7学时）第一节：蛋白质序列测定的基本战略和步骤（pp86-88）一、 序列测定的基本战略（pp86-87）1S. Moore基本战略（又称两种或两种以上的特异性裂解）这种战略由美国科学家S. Moore于50年首创，且至今仍在沿用。它的要点是：用两种方法分别将蛋白质的肽链专一性的切断，各自得到一系列的肽段；将这些肽段分离纯化，测出它们的序列；将两套肽序列的结果对在一起，得到蛋白质的一级结构。原则上，只要两套断链的切点都不同，就能解出一级结构。（图3-1A）由于此法所用的试剂易得，所以现在仍然被广泛使用。（参见111页，图3-15）特异性裂解，根据裂解

12、的方法可以分为两类：l 酶法裂解：产生的肽较小（5-20个残基），适用于手工序列分析；l 化学法裂解：产生的肽较大（50-100个残基），适用于序列机分析。2 逐级特异性裂解战略（见图3-1B）是70年代后提出的方案。此法优点是：可以防止盲目性，有利于以后肽链的重排，也可以使分离纯化简单；缺点是：所需的断裂试剂种类多，选择合适的断裂试剂很难。3 选择测序战略的主要依据l 所掌握和具备的肽链裂解方法；l 所具备的分离纯化条件；l 寻找接头肽（重叠肽）。二、 序列测定前的准备工作及测定的一般步骤（pp87-88）、序列测定前的准备工作1 蛋白质制剂的提纯和纯度要求：蛋白质制剂的提纯方法详见第二章。

13、一般要求其纯度在97 %以上，如果杂蛋白含量超过了5 %时便很难测定序列，蛋白质制剂中的杂质蛋白含量达到一定程度时，一级结构的研究结果将是没有意义的。2 蛋白质的分子量测定：这个数据对于确定蛋白质肽链的组成是很重要的。测定分子量的目的主要是为了估计序列工作量的大小。对分子量测定的准确性要求不高，误差在10%左右就足够了。常用的方法有：l 凝胶层析法：包括“凝胶柱层析测定法”和“凝胶薄板层析法”。第一版103-106页l SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：第一版106页；第二版57-59页l 沉降分析法：包括“沉降速度法”和“沉降平衡法”第一版101-103页3 确定组成蛋白质的多肽链（亚基）的数目、种

14、类和大小：l 亚基的数目：采取亚基拆离处理之后，如果蛋白质的分子量变小了，就说明蛋白质是由多条肽链组成。测量每分子蛋白质所含的N-末端残基数目，或者SDS凝胶电泳带的数目，都可以确定亚基的数目。拆离处理的方法根据亚基间交联的化学键的种类有所不同：如非共价交联，可用高浓度变性剂（如8mol/L尿素）拆离；二硫键共价交联，可用过甲酸氧化法和还原-羧甲基化法拆离。l 亚基的种类：组成蛋白质的亚基可能是相同的，也可能是不同的。是否相同，可以用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、N-末端测定法和高压液相色谱法（HPLC）来确定。如果相同，则不需要分离处理；如果不相同，就要进行分离和提纯处理，并制备供分析用的足够

15、的样品。l 亚基的分子量：测量方法与蛋白质的相同。序列测定的一般步骤其工作内容包括：1 蛋白质和肽的氨基酸组成分析2 末端氨基酸的测定3 肽链的专一性水解和肽段的分离纯化4 肽段的序列测定5 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构以下各个步骤作详细的介绍。第二节：蛋白质和肽的氨基酸组成分析（pp88-92）氨基酸组成成分分析是蛋白质化学的重要内容之一，也是序列测定的重要组成部分。要测定蛋白质的氨基酸组成，首先要把蛋白质水解成游离氨基酸的混合物。一、 蛋白质的水解（pp88-89）常见的有：盐酸水解法、磺酸水解法、酶水解法，以下分别介绍：1 盐酸水解法：本法是目前应用最广泛的一种方法。方法较为简便，而

16、且，除了能够较满意的得到除色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）之外的所有氨基酸。方法：使用重蒸5.7mol/L盐酸（恒沸点盐酸），在密闭的水解管中，加热至105110进行蛋白质水解。持续2472小时。注意：色氨酸（Trp）基本上全部被破坏，必需用其它的方法测定；含硫类的半胱氨酸（Cys）可被部分破坏和氧化，最好是在氧化成稳定的磺基丙氨酸后再测定其含量。 羟基类的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）分解缓慢。要准确测定，需要做几个水解时间的实验，然后测定的氨基酸含量，再外推到分解时间为零时的含量。含有脂肪族的缬氨酸（Val）和异亮氨酸（Ile）由于支链的空间障碍，而水解缓慢，所以水解的时间要比较长

17、。酰胺类的天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）在酸水解时，会脱酰胺，全部变为天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）。可以利用脱酰胺时放出的氨气的数量来测定它们的总量。含硫类的甲硫氨酸（Met）盐酸水解时，易被氧化，转变为甲硫氨酸砜，损失20%左右。可以用这一数值来进行校正。如果在水解时加入0.11.0 % 巯基乙酸和0.050.1%的苯酚，可以使丝氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）回收率明显提高，甲硫氨酸（Met）也不破坏。2 磺酸水解法：磺酸是非氧化性强酸，用它来代替盐酸有许多优点，近年已被广泛使用。方法：用4mol/L甲基磺酸，内含0.2 % -吲哚基乙胺（色胺）作水解剂。在密闭的水解管中，

18、加热至105110进行蛋白质水解。持续2472小时。优点：水解液是中性的，水解后可以直接上机分析；本法可使色氨酸（Trp）的回收率达到90%以上；使羟基类的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）回收率接近定量值。注意：注意细心地用碱将水解液中和至中性，这一点较难掌握；局限性：当水解液中存在碳水化合物时，色氨酸（Trp）容易被破坏，因此对糖蛋白分子，不能用本法测定色氨酸。半胱氨酸（Cys）的测定较为复杂：待水解结束后，加入二硫苏糖醇还原水解液中的胱氨酸，然后用过量的连四硫酸钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸，加以测定。3 酶水解法：方法：选用专一性低，水解活力高的蛋白酶水解。缺点：酶水解法最大的问题是水解

19、不彻底，回收率不够高。优点：在盐酸水解法中容易破坏的色氨酸（Try）、天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）等都可以用酶水解法直接得到。二、 氨基酸的分离和定量测定（pp89-90）氨基酸的分离和定量测定采用的是“氨基酸自动分析仪”。1 分离原理：为离子交换层析，使用的柱材料为磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。在pH 2.0的条件下，全部氨基酸都能牢固地结合在树脂上。不断地提高pH值和离子强度，可以将氨基酸依次洗脱下来，从而达到分离的目的。2 定量原理：洗脱下来的氨基酸与茚三酮起反应，生成紫色化合物（Ruheman紫），可用分光光度计于570nm比色处测定（见89页式3-2）。仅仅脯氨酸（结构不符

20、合通式）例外，与茚三酮反应生成黄色化合物，于440nm处比色测定。根据每种氨基酸的峰高或峰面积，分析仪自动计算出各氨基酸摩尔浓度（作为分子）、被测蛋白质的摩尔浓度（作为分母）和某氨基酸的残基数（商）。目前，氨基酸自动分析仪已经达到了很高的技术水平，充分体现了快速、微量和自动化（见90页，图3-2）。三、 特殊氨基酸的测定（pp90-92）1 色氨酸（Trp）的测定：由于在盐酸水解过程中，色氨酸几乎全部被破坏，所以测定色氨酸要用其他的方法。除了改良的水解法之外，还有两种光吸收法：紫外吸收法：方法：先将蛋白质样品溶于6mol/L盐酸胍溶液中，然后采用紫外分光光度计分别在280nm和288nm处蛋白

21、质溶液的光吸收值A280和A288。原理：由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）在280nm和288nm的紫外区有光吸收，因此可用完整的蛋白质样品进行色氨酸的测量。色氨酸在280nm和288nm的摩尔消光系数分别是4815和5690；酪氨酸在280nm和288nm的摩尔消光系数分别是358和1280。根据测定混合物中两种物质的比尔定律，可以得到（酪氨酸的摩尔浓度是已知的）：2 对-二甲基氨基苯甲醛法：色氨酸的吲哚核在强酸条件下与醛反应生成带色产物。在这个反应中，含有色氨酸的蛋白质的碱性水解液加入对-二甲基氨基苯甲醛的浓硫酸溶液（10%），再加入亚硝酸纳溶液，经一定时间之后，生成蓝颜色，颜色的深

22、浅与色氨酸含量成直线关系。该带色物质的最大吸收峰位在590nm处。该法已经广泛采用，结果可靠。2 巯基测定：测定巯基常用下列两种比色法：DTNB法：DTNB（即5.5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸，表达为ESSE），与巯基反应后生成CNT（即4-硝基-3-羟基硫酚，表达为ES-），在412nm处的摩尔消光系数为11400 L/mol.cm。Protein-S-（蛋白质）ßESSE（即：DTNB）Protein-SSE + ES-ßProtein-S-（蛋白质）Protein-SS-Protein + ES-萘醌测定法：萘醌与巯基有当量加成关系，加成物在420 nm左右

23、有吸收峰，标准物和未知物在相同条件下测定，光密度增值与巯基浓度成正比。3 二硫键的测定：Ellman试剂法：Protein-SS-Proteinß Protein-S- + 2 ESSE3 Protein-SSE+ ES- （pH10.5之前测得的ES-数）ßpH=10.53 Protein-S-+ 3 ES-（pH10.5之后测得的ES-数）二硫键的数目=(pH10.5之后测得的ES-数)-2(pH10.5之前测得的ES-数)¸2上式中二硫键的数目=（4）-2（1） ¸2 = 1NTSB法：NTSB（即2-硝基-5-硫代苯磺酸，表达为ESSO3-）Pr

24、otein-SS-Proteinß SO32-（过量亚硫酸盐）Protein-S- + Protein-SSO3-ßESSO3- （NTSB）Protein-SSO3-+ ES-二硫键的数目= ES-的数目。RS- 在412nm处的摩尔消光系数为11400 L/mol.cm。4 氨基的测定：测定蛋白质和肽中的氨基酸常用NTBS法、荧光胺法和邻苯二醛-2-巯基乙醇法。三种方法的特点如下：NTBS法：NTBS（即 2,4,6-三硝基苯磺酸），此法比较灵敏。在温和条件下试剂即能与伯胺定量反应，产物可以用分光光度法测定。荧光胺法：荧光胺能与伯胺反应，生成荧光团，荧光团可在390nm

25、被激发，在475nm发出荧光。荧光强度与伯胺浓度成正比。优点是：游离氨的干扰极低；灵敏度可达到pmole数量级。邻苯二醛-2-巯基乙醇法：邻苯二醛在2-巯基乙醇存在的条件下，与伯胺生成强荧光物质，可在340nm被激发，在455nm测量荧光。优点是：在水缓冲液中可溶而且稳定；灵敏度比荧光胺还高5-10倍。第三节：末端氨基酸的测定（pp92-98）末端分析可分为N末端的测定和C末端的测定两个方面。一、 N末端的测定（pp92-96）组成蛋白质每条多肽链的第一个氨基酸与内部的氨基酸不同，它具有-氨基，这正是进行末端氨基酸测定的基础。N末端测定法的共同原理是在N末端引入某种标记基团，这些基团或具有颜色

26、，或具有荧光、紫外吸收等特性。酸水解多肽，获得氨基酸混合物。然后分离鉴定具有这些基团的氨基酸衍生物。1 DNFB法：（传统的方法）原理：DNFB（即2,4-二硝基氟苯）在温和的条件下（pH8.0-9.0，室温）与肽链的N端氨基作用，形成二硝基肽链（简称DNP-Peptide）。这个键结合很牢固，经盐酸水解仍然不断裂，水解后形成的DNP-氨基酸（黄色），可以用乙醚抽提出来，进行层析，根据斑点的位置作定性鉴定；或用温热的1%NaHCO3洗脱后，测360nm波长的吸收作定量测定。反应过程：H2N-Peptide-COOHß DNFB，室温，pH8-9DNP-HN-Peptide-COOH

27、+ HFß H+ 水解，105DNP-氨基酸 + 氨基酸（2n）注意：DNP-氨基酸见光易分解，所以操作应在暗处进行；DNFB不仅与N端的-氨基起反应，也与侧链上的-氨基、巯基、酚羟基和咪唑基反应，但因水解产物极性较强，不被乙醚抽提，故不干扰N端测定。有些DNP-氨基酸：-DNP-His、DNP-Arg、DNP-Cys、O-DNP-Tyr等均溶于水，不被乙醚抽提，故应将水蒸干，分别鉴定。如果检测不出DNP-氨基酸，则可能有以下原因： 被分析的肽链N端是封闭的，例如：焦谷氨酰基、乙酰基等； N端为缬氨酸（Val）和异亮氨酸（Ile），其肽键耐酸，要延长水解； N端为脯氨酸（Pro）和甘

28、氨酸（Gly），两者易破坏，需缩短水解。2 丹磺酰氯分析法：（广泛使用的方法）原理和方法：二甲基萘磺酰氯（DNS-CL）是一种荧光试剂，能专一地与N端的-氨基起反应，生成氨磺酰衍生物DNS-Peptide，反应结束后，将反应液移至水解管中，真空干燥，然后加盐酸水解18小时。经盐酸水解后，得到DNS-氨基酸（强烈荧光）和其它的游离氨基酸，水解液真空干燥后用无水乙醇溶解，可以直接用电泳或层析法鉴定，（参见图3-3）。反应过程：H2N-Peptide-COOHß DNS-Cl，pH8-9DNS-HN-Peptide-COOH + HClß H+，105，18hDNS-氨基酸 +

29、氨基酸（2n）优点：灵敏度高，比二硝基氟苯高100倍，检测灵敏度可达10-9-10-10摩尔；操作简便，水解产物不需提取，直接电泳或层析；虽然组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cyr）的巯基、酪氨酸（Tyr）的酚基和-氨基酸也能和试剂反应，但不会影响测定结果。其他的N末端测定方法有：异硫氰酸苯酯法、DABITC法等，将在第五节介绍。3 焦谷氨酰残基的降解：谷氨酰胺（Gln）发生环化反应，生成焦谷酰胺环化衍生物是封闭N末端最常见的情况之一（见95页，式3-14）。目前降解N末端焦谷酰胺残基有两种方法：酶解法：用市售的焦谷酰胺肽酶，可以将焦谷酰胺从肽链上酶解下来。化学降解法：（96页式3-16是

30、错误的）写信问过再讲。二、 C末端的测定（pp96-98）1 肼解法：此法是目前测定C末端残基最主要的方法之一。原理和方法：当蛋白质与无水肼在100反应5-10小时之后，除了C端氨基酸之外，所有其他氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼，C端氨基酸以游离氨基酸释放出来，借助DNFB试剂和分级抽提的方法，再用层析技术可鉴定出种类和数目。反应过程：（见96页，式3-17）注意：肽的C端为半胱氨酸（Cys）和胱氨酸时，两者在肼解时会分解，必须先氧化或烷基化后再肼解、才可测量。2 C末端选择性氚标记法：反应过程：（见97页，图3-4）：用醋酸酐处理多肽，形成C端酮环；在氚水存在的情况下，碱催化恶唑环消旋反应，

31、将氚引入恶唑环；打开恶唑酮环，重新形成C端氨基酸，此时C端氨基酸的-碳原子已经被氚（3H）标记；经水解之后，分离鉴定氚标记的氨基酸。注意：此法不适于脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）的测定。3 羧肽酶法：此法也是目前测定C末端残基最主要的方法之一原理：羧肽酶是一类外切酶，能专一地从肽链的C末端开始逐个降解，释放出游离氨基酸。释放出来的氨基酸数目和种类随时间变化，可用自动氨基酸分析仪作定性和定量测定（见98页，图3-5、图3-6）。反应过程：（见97页，式3-19）AA1AAn-2-AAn-1-AAnß 羧肽酶AA1AAn-2-AAn-1 + AAnß 羧肽酶AA1AAn-

32、2+ AAn-1ß 羧肽酶优点：一次就能从C端释放出一至数个氨基酸残基。注意：变性剂的使用：使用SDS或6mol/L脲，既不影响羧肽酶的活性，又可以破坏蛋白质的二、三级结构，使一级结构不同的C末端氨基酸的释放速度趋于相近（甘氨酸、脯氨酸很慢；亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸很快）。足够的酸化：可以稳定羧肽酶的活性，提高测定效率；同时足以抑制羧基上的正电荷，加快释放速度。选择合适的羧肽酶：见98页，表3-1。4 减数C末端测定：（仅适用于小肽）原理和反应过程：将肽的N端固定在多孔玻璃球上；用二-P-硝基苯磷酸迭氮物处理，使-COOH转为-CON3（酰迭氮化物）；加热，使-CON3热解成-NCO

33、（异氰盐）；产物经酸水解后，使C末端残基破坏；通过反应前后的氨基酸的组成变化确定C末端的氨基酸。玻璃球-peptide-AA-COOHß二-P-硝基苯磷酸迭氮化合物玻璃球-peptide-AA-CON3ß加热玻璃球-peptide-AA-NCOß酸水解玻璃球-peptide5 还原法：是很老的方法，现在一般不用。第四节：肽链的专一性水解和肽段的分离纯化（pp98-105）一、 肽链的专一性水解（pp98-104）通常用降解法测肽链的氨基酸序列，一次只能连续降解10个残基；用手工方法测序，一次最多能测20多个残基。所以必须将大肽先裂解为小肽，然后再分别测定各个肽段的

34、序列，最后才能解读出整个蛋白质的氨基酸序列。方法分为两类：化学法裂解和酶法裂解。裂解前必须注意三个问题：使用酶法时，需考虑：是让蛋白质在天然状态下裂解？还是先变性，后裂解？裂解时，是否想完整保留二硫键？在裂解和提纯的过程中，是否出现了原来并不存在的二硫键？1、 蛋白质的化学法裂解特点：化学法裂解的肽段一般较大，适合于用自动序列分析仪测定，同时有利于肽段的吻合，特别适合分析分子量较大的蛋白质。1 溴化氰（CNBr）裂解：原理：溴化氰能与蛋白质中的甲硫氨酸（Met）R侧链中的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯。此产物与水进一步反应，将肽键断裂。N端一侧的C端成为高丝氨酸内酯，C端一侧的N端不改变。因为蛋

35、白质一般含甲硫氨酸较少，所以能够得到较大的肽段。反应过程：反应时间24小时-Met-NH-AA-ß BrCN-Br-+Met-CN-NH-AA-ß-溴化亚氨内酯= N+H-AA- +CH3-S-CNß H2O, H+-高丝氨酸内酯 + +H3N-AA-+ Br-ß H2O, OH（右侧小肽的N端）-高丝氨酸（左侧小肽的C端）方法说明：防止氧化：甲硫氨酸如果被氧化为砜和亚砜，则不能发生裂解反应，所以整个反应要在氮气容器中进行；溴化氰对甲硫氨酸要过量50-100倍（摩尔比）；反应时间24小时；CNBr裂解采用酸性条件，可引起Asp-Pro（天冬-脯）键的断裂

36、，如果某一序列含有这个键，所得的肽段数目就比根据甲硫氨酸预计的数目多。注意：当溴化氰裂解含Met-X肽键时，X的性质可以影响裂解速度；当X为羟基类丝氨酸或苏氨酸时，可以使甲硫氨酸变成高丝氨酸，因而不能裂解肽键（见100页，图3-7），解决方法为增加CNBr的使用量。优点：产率高（85%）、专一性强、切点少，使用广泛。2 BNPS-Skatole法：原理：BNPS-Skatole是一种温和的氧化剂和溴化剂，可以对芳香族的色氨酸（Trp）有专一性裂解能力。它可以色氨酸的残基的右侧（C末端一侧）裂解肽键。因为蛋白质一般含色氨酸极少，所以能够得到大的肽段，成为很有用的裂解方法。反应过程：（见101页，

37、图3-8）注意：由于试剂对光敏感，不稳定，所以反应要在暗处进行；甲硫氨酸（Met）可以与试剂发生作用，反应结束后可以使用巯基乙醇消除影响；酪氨酸（Tyr）也可以与试剂发生反应，如果加入过量的酪氨酸则可以这种反应的发生。3 亚碘酰基苯甲酸裂解法：原理和方法：此试剂可在相当温和的条件下裂解Trp-X（色-X）肽键，其机理也是氧化吲哚环。产率高达70-100%。蛋白质溶解于4mol/L盐酸胍（用80%醋酸液配置）中，再加适量甲酚。于室温、暗处反应24小时。过量试剂用DTT破坏。反应过程：（见101页，图3-9）注意：要用纯化的亚碘酰基苯甲酸，因为杂质碘酰基苯甲酸可以在His-X键上裂解。甲酚的功能就

38、是清除残余的碘酰基苯甲酸，改善裂解的选择性。4 X-Cys（X-半胱）键的裂解：有两种试剂可以在半胱氨酸N端侧专一性裂解肽链，裂解产率90大于%：NTCB, 即2-硝基-5-硫氰苯甲酸；Cyssor, 即（2-甲基）-N-1-苯磺酰胺。反应过程见102页，图3-105 羟胺裂解法：羟胺能够专一性裂解Asn-Gly（天冬酰胺-甘氨酸）之间的肽键，因为出现的几率很低，所以此法降解的肽段都很大，对分子量大的蛋白质测序十分有用。原理：通过羟胺作用，先形成琥珀酰亚胺环状物，最后导致Asn-Gly键裂解。方法：先制备含6mol/L胍的2mpl/L羟胺溶液，用NaOH调pH至9.0；加入蛋白质（浓度为4-5

39、mg/ml）；反应条件为：pH9.0、45 、4-5小时；加0.1体积的醋酸终止反应。反应过程：Peptide-Asn-Gly-PeptideßPeptide -环亚酰胺-Gly- Peptideß NH2OH（羟胺）Peptide -Asp-羟胺 + Gly-PeptidePeptide -Asp-羟胺6 Asp-Pro键的裂解（部分酸水解法）：老方法，专一性不好。2、 蛋白质的酶法裂解1优点： 专一性强； 降解后的肽段容易纯化； 裂解产率较高； 副反应少，在酸水解中容易被破坏的Gln、Asn 和Trp等在酶解时不受影响。2影响因素： 合适的pH值； 合适的反应温度； 恰

40、当的蛋白质与酶的比率； 选择相应的反应时间； 待裂解蛋白质的物理状态。注意实验前做好预实验。3常用的内切酶：胰蛋白酶：高度专一性，只切碱性的Lys（赖）和Arg（精）的右侧，常用；胰凝乳蛋白酶：专一性宽，芳香族氨基酸的右侧；胃蛋白酶：专一性更宽，芳香族氨基酸和Leu（亮）；枯草杆菌蛋白酶：专一性差，裂解出足够小的肽段；木瓜蛋白酶：专一性差，但对Lys（赖）和Arg（精）的右侧敏感；嗜热菌蛋白酶：耐热，所有疏水氨基酸的的左侧，很常用；新近发现的高专一性蛋白水解酶：Glu蛋白酶（谷右）：来自金黄色葡萄球菌，又称（V8蛋白水解酶）； Arg蛋白酶（精右）：又称Clostripain，已广泛用于蛋白质

41、序列分析； Lys蛋白酶（半左）：来自A. mellea菌， Pro蛋白酶（脯右）：来自小羊的肾细胞。二、 肽段的分离纯化及纯度鉴定（pp104-105）1、 肽段的分离纯化原因：肽键裂解后得到各种不同大小肽段的混合物，在序列测定之前一定要分离归类，每种肽段都要纯化（工作量非常大）。原理：根据肽段的理化特征，包括：分子的大小、电荷、极性、溶解度、以及与特殊的共价键和非共价键结合等特性进行分离和纯化。方法：凝胶过滤法、离子交换法、薄层层析法、薄层电泳法、毛细管电泳法等。1 对角线法：（一种独特的传统方法）不改变肽段性质：在双向电泳或者双向层析中，若两个向上的电泳或层析都在相同的条件下完成，结果会

42、得到对角线图谱，即所有的组分（肽段）的斑点都分布在一条对角线上。改变某些肽段的性质：如果有些肽段在第一向和第二向的迁移率不同，则它们就不会分布在对角线上，因此，可以被表征、分离。要使肽段在两向上的迁移率不同，就要在第一向分离后，改变某个肽段的性质。被改变性质的肽段在第二向分离后，就可以离开对角线。举例：如果某个肽段含有二硫键，则可以在第一向之后，将二硫键还原，这时含有二硫键的肽段会裂解为两个更小的肽段，再进行第二向分离，它们就会离开对角线，得到分离。适用范围：含巯基、甲硫氨酸、赖氨酸的肽段，和胰蛋白酶降解后的C端肽段。2 高压液相色谱法：（广泛使用的方法）特点：收率高：一般大于90%，有时高达

43、100%；分离快速：传统方法要几天完成的任务，HPLC只需要1小时；灵敏度高、分辨率高：很微量（10ng）的肽段也能分离；2、 肽段定量检测方法：1 紫外吸收法：肽键在200-210nm处有强吸收，是最方便的定量方法；2 茚三酮比色法：570nm处比色。常用，但灵敏度低；3 邻苯二醛荧光法：激发波长340nm，发射波长455nm。灵敏度高出茚三酮法1-2个数量级。（紫外线：400nm；可见光：>400nm）3、 肽段纯度鉴定：在肽混合物分离过程中，常常要鉴定个别分离物的纯度，以便决定是否需要进一步提纯。虽然层析和电泳中只有一条带（一个斑）即可能是纯肽。但是一般说，鉴定肽是否纯的唯一标准是

44、：纯肽只有一个N端。这是因为，如果有二硫键的存在，可能使两条肽段连在一起，虽然层析和电泳时只有一条带或一个斑；但是出现了2个N端，这表明不是纯肽。第五节：肽段的序列测定（pp105-111）一、 手工序列测定技术（pp105-110）包括：化学法、酶学法1、 Edman化学降解法：迄今仍然是最基本和有效的方法。原理：蛋白质或多肽的自由-氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）耦联之后，与其紧邻的第二个氨基酸残基的键合力大大减弱，很易断裂，所以在无水酸作用下，仅切下自由-氨基的残基，切下的氨基酸被抽提，并被鉴定。当切下N端这个残基后，紧邻的那个残基（第二个）便暴露出来，成为了新的自由-氨基酸，又可与PIT

45、C进行耦联反应，再切下第二个残基，以此循环。至多可以测定60-70个残基。反应过程：（见106页，式3-13）提前去教室画图1 耦联反应：肽的自由-氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）在碱性条件下发生耦联反应，生成异硫氰酸苯酯肽（PTC-肽）。2 断裂反应：在强酸作用下，PTC-肽的近N端肽键断裂，产生2-苯胺基-5-噻唑啉酮衍生物（PTZ），同时形成少了一个氨基酸的新肽，新肽的N端仍然是自由的，可以进一步与PITC反应，进行第二次降解。3 转化反应：断裂产物PTZ不稳定，为了随后的N端氨基酸分析测定，将PTZ转化为3-苯基-2-乙内酰脲（PTH-AA）。分析方法：每一次循环之后，可用乙酸乙酯抽提生

46、成的PTH-AA。PTH-AA非常稳定，抽提后可以用薄层层析、气相色谱、高压液相色谱法、回水解法（指的是：用酸水解PTH-AA，使其转化为游离氨基酸，再用氨基酸分析仪分析）分析，确定这一轮是某种氨基酸。反应的限制因素：关键是肽转变成PTC-肽，及随后降解反应的产率。如果这两步的总产率是95%，则可以连续测定15个残基（总产率约45%）；如果这两步的总产率是99%，则可以连续测定60-70个残基（总产率约50%）。2、 减数Edman序列分析法：这是一种改良Edman降解技术。每一种反应阶段之后，将未反应的肽水解，并进行氨基酸组成的全分析，可用氨基酸自动分析仪或纸电泳的方法。依据氨基酸减少的情况

47、，可以推断出N端氨基酸的排列顺序。对于小肽来说，此法更快、更准确，只要一台氨基酸自动分析仪就够了。少于10-15个残基的小肽可用本法来测定。3、 DNS-Edman序列分析法：这也是一种改良Edman降解技术。此法将高灵敏度的丹磺酰氯技术（DNS-Cl，参见94页）与能连续降解的Edman降解反应有机地结合起来。原理： DNS的作用：降解、标定、检测末端氨基酸：由于水解后的生成物是带荧光的DNS-AA，其检出的灵敏度比Edman法高出一个数量级。 PITC的作用：降解、清扫剩余的末端氨基酸，为下一步的测序清除障碍。缺点：在与DNS-Cl的反应中，谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）误读为谷氨

48、酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），而且不能检出色氨酸（Trp）。反应过程（见107页，式3-14）：提前去教室画图4、 DABITC/PITC双耦合法：一种改良Edman法，灵敏度非常高。原理：与DNS-Edman法类似。 DABITC的作用：降解、标定、检测末端氨基酸。层析出的DABTH-AA，经盐酸蒸气熏，能显示红色的斑点，而杂质和试剂的反应物显蓝色或紫色斑点，极大地提高灵敏度，只需微量的样品即可，灵敏度达到p mol的数量级。 PITC的作用：降解、清扫剩余的末端氨基酸，为下一步的测序清除障碍。由于DABITC（4-N,N-二甲基氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯）耦合的反应产率低，一般不到50

49、%，故用PITC（异硫氰酸苯酯）作再次耦合、降解，其到清扫剩余的末端氨基酸，提高反应产率的作用。反应过程：见108页式3-21（DABITC的作用）。5、 酶学降解测定肽序列（了解一下，实际中困难很多）1 氨肽酶法：氨肽酶是专一性从N端逐个降解多肽的一类外肽酶。种类很多。2 羧肽酶法：特点是能从C端专一性逐个降解多肽，和化学法及氨肽酶法不同。3 外肽二肽酶法：每隔两个残基切一次。分二肽氨肽酶和二肽羧肽酶两类。二、 自动序列分析（pp110-111）有三类蛋白质序列仪：液相序列仪、固相序列仪、气相序列仪。基本原理相同，都是采用Edman反应，逐个降解N端残基，然后自动检出残基性质和数量，最后自动

50、报告肽链的氨基酸序列。1 液相序列仪：优点：收率高，可达97%；可以连续测定20-50残基。缺点：不适合于小肽的测定（易从反应杯中洗出）。2 固相序列仪：优点：可以测定小肽；可以测定疏水性肽。缺点：收率低（结合到了固相上），有时仅20-30%。3 气（液固）相序列仪：灵敏度高，可以测定5 p mol水平样品；试剂和溶剂消耗低，约为液相的1/10；速度快，最多一次可以测定55个残基；收率高，重复收率可以达到98%。缺点：非常昂贵，非一般实验室所能设置。第六节：由已知序列肽段建立蛋白质一级结构（pp111-113）一、 重叠肽（接头肽）（pp111-111）寻找重叠肽，是S. Moore基本战略的

51、关键之一。1 S. Moore基本战略的原理：必须使用至少两套切肽链的方法，得到两套以上的肽段氨基酸排列顺序。而且，每套断链的方法没有相同的切点，这样就出现了下图的情况。因此，可以借助重叠肽，建立蛋白质一级结构。原始肽链 NC 1 2 3第一套肽 N C（共7段） 第二套肽 N -C（共4段） 1' 2' 3'2 重叠肽的概念：第一套肽段较小，有数个肽段（1, 2n）正好跨过了第二套肽的相应的缺口（1', 2'n'）。在第一套肽段中，那些可以跨过第二套肽段缺口的片段被称为重叠肽，通过对比氨基酸残基排列顺序的方法，它们所具有将第二套肽正确对接和排列

52、的功能。二、 二硫键位置的确定（pp112-112）原理：我们知道，二硫键是构成蛋白质三级结构和四级结构的主要作用力之一。它在一级结构中的物质基础是半胱氨酸（Cys）。为了测定蛋白质的一级结构，肽链中的二硫键都被还原成为半胱氨酸，并用烷基化法保护。在一级结构测定完毕之后，就可以确定二硫键的位置了。方法：1 酶切法：用酶来水解原蛋白质，可以保留二硫键的完整性。再找出含有二硫键的肽段，将这个肽的二硫键拆开，分别测定拆开后的两条肽段的序列，将这两条肽段的氨基酸残基排列顺序与原来的一级结构对比，就能找出相应的二硫键的位置。2 14C-碘乙酰胺封闭法：若二硫键在一条肽链中存在，而且该肽链内还有另一个半胱

53、氨酸（Cys），则在二硫键未被拆开之前，将独立的半胱氨酸用14C-碘乙酰胺封闭和标记。这样就可以确定那两个Cys组成了二硫键。3 双酶切法：如果一条肽链内含有两个二硫键，用胰蛋白酶水解又得不到含有一个二硫键的肽段时，可以进一步用胰凝乳蛋白酶水解，或用其它方法水解，直到得到含有一个二硫键的肽段，然后按前述的方法确定二硫键的位置。三、 酰胺基位置的确定（pp112-112）原理：在蛋白质和肽的氨基酸组成分析时（第二节、一、蛋白质的水解），如果发现有酰胺基存在，则在本阶段一级结构的研究中就要确定酰胺键的确切的位置。多肽链中的侧链和C端的羧基（即Glx或Asx）：有可能以-COOH形式存在（谷氨酸Glu或者天冬氨酸Asp），也可能以-CONH3形式存在（谷氨酰