遗传性疾病的分子诊断12am

1、DNADNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录反转录反转录 翻译翻译 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 基因结构异常基因结构异常基基 因因 表表 达达 异异 常常PCR DNADNA测序测序 Nothern-blot 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR 反转录反转录PCRPCR 蛋白质芯片蛋白质芯片 ELISA 蛋白组织化学染色蛋白组织化学染色 Western-blot 基因芯片基因芯片 基因诊断的技术和方法基因诊断的技术和方法遗传性疾病诊断策略遗传性疾病诊断策略 1. 点突变的诊断点突变的诊断 方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交（方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO）、）、PCRPCRELI

2、SAELISA、等位基因特异性扩增（、等位基因特异性扩增（ASAASA）、）、PCRPCRRFLPRFLP、基因芯片技术进行诊断；、基因芯片技术进行诊断； 对于一些基因背景未知的点突变，可以采用对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP）、变性梯度凝胶电泳）、变性梯度凝胶电泳（DEEGDEEG）、异源双链分析（）、异源双链分析（HAHA）、）、DNADNA序列测定、序列测定、蛋白截短测试等方法。蛋白截短测试等方法。 一、限制性内切酶法（一、限制性内切酶法（RE法）法） 导致某一限制酶识别位点导致某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入，移位的大片段缺

3、失或插入， 导致某一限制酶识别位点导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，丧失或获得的点突变， 均可引起相应限制性片段均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。的长度和数量发生变化。 分析限制性酶切图，即可分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。诊断出此类突变。Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制

4、性酶切分析二、二、ASO探针杂交探针杂交受检者基因组受检者基因组DNA或含或含突变位点的突变位点的PCR扩增产物扩增产物与标记的与标记的ASO 探针杂交探针杂交主要适用于检测已知点突变主要适用于检测已知点突变ASO1 ASO2NormalHeteroHomoPCR-SSCP 2.片段性突变的检测片段性突变的检测 片段性突变是指片段性突变是指DNADNA分子中较大范围的碱基发分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用

5、的方法，而对于大的片段突变，则使用SouthernSouthern印迹技术印迹技术和和多重多重PCRPCR技术。技术。 杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断 多重多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）对引物）P1 除外显子除外显子1 外其余均缺失；外其余均缺失； P2 外显子外显子819 有小的缺失；有小的缺失；P3 外显子外显子44-50 缺失；缺失； P4 外显子外显子4552 有小的缺失；有小的缺失；B1 空白对照；空白对照；C1、C2 正常对照。正常对照。遗传性疾病诊断策略遗传性疾病诊断策略 DNA多态（多态（DNA Polym

6、orphism）： 群体中每个个体群体中每个个体DNA区域中等位基因（或区域中等位基因（或片段）存在片段）存在两种或两种以上的形式两种或两种以上的形式，对，对基因功基因功能没有影响能没有影响，称，称DNA多态多态。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。中的标记。 将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法。的方法即为基因连锁分析法。 基因连锁分析基因连锁分析常用的遗传性多态性标记有常用的遗传性多态性标

7、记有3类：类：1）RFLP： 称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（重复序列多态性（VNTR）： 如短串联重复序列（如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；），为第二代多态性标记；3）单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP） DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。1 1 Southern blotSouthern blot-RFLP-RFLP诊断诊断(PKU)(PKU)间接基因诊断间接基因诊断 PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb

8、 两种等位片段，以PAH cDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。 患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH 基因与19kb片段连锁 其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁， 其23kb片段与正常PAH基因连锁。 II2为为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断间接基因诊断数目变异串联重复数目变异串联重复variable number tandem repeats, VNTR 重复序列以各自的重复序列以各自的核心序列核心序列（重复单元），首尾相（重复单元），首尾相连连多次重复多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人，称为串联重复序列，

9、其重复次数在人群中存在变异，形成多态即群中存在变异，形成多态即 VNTR。 散在分布于染色体上。散在分布于染色体上。 重复单位重复单位625bp长，长，称为小卫星称为小卫星DNA。重复单位重复单位26bp长，如（长，如（TA）n, (CGG)n等，等，称为称为微卫星微卫星DNA，又称短串联重复序列又称短串联重复序列(STR) 。 VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。片段。 DNA多态可以通过多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态扩增片

10、段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）VNTR 酶切，电泳后的检测结果大小PCR-VNTR检测PCR-VNTR成年型多囊肾病的诊断成年型多囊肾病的诊断 例：成年型多囊肾病例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKDGene定位定位16p13，但，但致病基因致病基因尚未克隆尚未克隆，基因产物基因产物的生化性质和疾病发病机理也的生化性质和疾病发病机理也尚未

11、阐明尚未阐明，但已证实但已证实APKD Gene与与珠蛋白基因珠蛋白基因3端附近的一端附近的一段段小卫星小卫星DNA序列序列（3HVR）紧密连锁紧密连锁，因此，可，因此，可以通过以通过VNTR连锁分析进行诊断。连锁分析进行诊断。间接基因诊断间接基因诊断 以以3HVR为探针，与为探针，与PvuII酶切后的家系有关成酶切后的家系有关成员的基因组员的基因组DNA进行进行Southern Blot 基因组基因组DNAPvuII酶切酶切DNA片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 间接基因诊

12、断间接基因诊断结果分析结果分析n 患者（患者（I1、II1和和II2）有）有3.4kb片段，片段，说明致病基因与说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟片段连锁，并按孟德尔方式遗传。德尔方式遗传。II5不含不含3.4kb片段，产前片段，产前诊断正常。诊断正常。间接基因诊断间接基因诊断单核苷酸多态单核苷酸多态Single Nucleiotide Polymorphism， SNPSNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据根据SNP在基因中的位置，分为：在基因中的位置，分为： 基因编码区基因编码区SNP 基因周边基因周边SNP 基因间基因间SNP在人类基因组中每在

13、人类基因组中每100300个核苷酸就有一个个核苷酸就有一个SNP 遗传性疾病遗传性疾病的主要分子机理是基因突变，的主要分子机理是基因突变，因而是基因诊断的最佳适应症。因而是基因诊断的最佳适应症。基因诊断在遗传性疾病中的应用基因诊断在遗传性疾病中的应用 血红蛋白病血红蛋白病 最早成功进行产前基因诊断可分为两大类： 异常血红蛋白病（abnormal hemoglobin syndrome） 地中海贫血（thalassemia）一、一、 遗传性疾病遗传性疾病 1）异常血红蛋白病）异常血红蛋白病珠蛋白基因突变（单硷基替代、缺失或插入等）珠蛋白基因突变（单硷基替代、缺失或插入等） 镰状细胞贫血：镰状细胞

14、贫血： b-珠蛋白基因第6位密码子GAGGTG (E6V) 该突变使限制酶MstII位点消失(CCTGAGGCCTGTGG) 诊断方法：诊断方法： 限制性酶切图谱直接分析法 (基因组DNA或PCR产物) ASO 斑点印迹杂交分析法 (ASO = 等位基因特异性寡核苷酸探针)Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基

15、因组的限制性酶切分析 b-珠蛋白基因点突变 GAG(Glu)-GTG(Val) bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC HeterobA probebS probeHomoNormal a-地中海贫血： 不同数量(1-4个)a-珠蛋白基因缺失或点突变等 a a 14kbBamHI BamHI aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/- 10kb 14kb 10kb a 2）地中海贫血地中海贫血 珠蛋白基因缺失或基因中某些硷基替代珠蛋白基因缺失或基因中某些硷基替代 影响影响a-a-或或b-b-珠蛋白链的合

16、成速率珠蛋白链的合成速率 a-a-或或b-b-地贫地贫诊断方法：PCR、酶切图谱法、PCR-ARMS、PCR-ASO b-b-地中海贫血地中海贫血 主要是b-珠蛋白基因点突变。 突变常不涉及限制酶识别位点 不能用限制性酶切图谱进行直接分析。 诊断方法：诊断方法： RFLP连锁分析连锁分析 间接检测间接检测病变基因病变基因 ASO 斑点印迹杂交分析斑点印迹杂交分析 直接检测病变基因点突变直接检测病变基因点突变 DNA芯片（包括芯片（包括各种基因突变位点的所有探针）各种基因突变位点的所有探针） 可快速、简便地检出所有已知突变可快速、简便地检出所有已知突变 甲型血友病甲型血友病（血友病A） 凝血因子VIII（F VIII）缺乏所致， 发病的分子机制是F VIII基因突变，主要为点突变或少数硷基 的缺失和插入以及第22内含子的大片段倒位。 乙型血友病乙型血友病（血友病B） 起因于凝血因子IX的缺乏 其分子机制是分布于整个基因各处的多种形式的突变。 诊断方法：诊断方法：PCR/ASO直接检测法（点突变） PCR/RF