动物实验室疾病诊断工作流程

1、生物实验室疾病诊断工作流流程程接收流程：内勤一一研发部一一生物实验室业务反馈流程：生物实验室实施细贝I:、样品采集与运输1 .病料的采集要求：(1) 新鲜，代表性。病料存放时间夏天少于6h,冬天12-24h.(2)减少污染。第一时间采取病料，减少病料因暴露于空气中而造成的污染。(3)病料采集后，应先存放于冰箱中 1-2小时后，再做微生物检验2 .病料的采集方法(1 )组织和实质器官的采集 采集病料心、肝、脾脏、胰腺、肺等，剪切小块组织，密封。放入灭菌试管(青霉素瓶)(2)液体病料的采集血液、胆汁、脓肿液、渗出物等液体病料，使用注射器(或灭菌吸管)吸 取病变组织的液体，将病料注入灭菌试管(青霉素

2、瓶)(3 )全血的采集方法用注射器自鸡的心脏或遹静愉篥海检。(4)血清的采集方法2-5毫升，注入灭菌试管(青霉素瓶)中。用灭菌注射器自鸡的心脏或翅静脉采血2毫升，注入灭菌试管中(青霉素瓶)摆成斜面，待血 液凝固血清析出后，将血清吸出注入另一个灭菌试管中，备用。采样的比例：按每个舍0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常规采样15-30份即可。、检测项目项目一、药敏试验试验步骤1 .试验材料：培养基、药敏试纸、细菌、接种环、酒精灯、打 孔器、移液器、滴头。2 .试验准备：药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药使用治疗量的比例配制药 液；如商品药“百病消”按其说明量治疗量0.01%饮水，

3、可按这个比例配制药液, 可取1 o毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏 试验的药液。3 .试验操作方法： 3. 1药敏片法3. 1. 1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培 养 物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别 在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的l/2o找到第 二点划线至平皿 的1/2,依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培 养基表面，涂布均匀致密）。3. 1.2将镇子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养

4、基表面。为了使 药敏片与培养基紧密相贴，可用镣子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求 药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若 干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。3. 1. 3将平皿培养基置于37C温箱中培养24小时后，观察效果。二、结果观察:过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小， 若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直 接关系。三、结果判定药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。实验条件不同，判定标准有所不同。对于一般抑菌环的直径，20

5、mn以上极敏；15mm以上者为高度敏感；10-15 mn为中度敏感；10mm以下为低度敏感；无抑菌环者为 耐药。抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm)(p g不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素/mL)0< 1010 -26>26链霉素5000< 1010 -15>15氯霉素7000< 1010 -20>20新霉素3000< 1010 -25>25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上为高敏，6-9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。四、应用药物敏感试验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，这样才会达到好的治疗效果。项

6、目二、抗体试验一、实验用设备：离心机1台、冰箱1台、振荡器1台、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸头、积液槽、一次性 采血管、2毫升注射器、红细胞、柠檬酸三钠、重铭酸钾、硫酸、吸管、吸耳球、针头、蒸储水、10 毫升离心管、生理盐水。二、实验过程：（一）血凝（HA ）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价（二）4单位抗原校正：HI ）试验：每排孔检查1份血清。（三）血凝抑制（四）结果判定：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的1）判定结果：指数表示。2）判足标准：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。2 .H5抗体：抗体值在6以上。3 .H9抗体：抗体值在7以上。注：低于

7、以上标准，则需要进行免疫。4 ）免疫后抗体规律一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10- 15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。项目三、PCR检测一、PCR反应的条件设置PCR反应条件为温度、时间和循环次数。1 .温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点 法，双链 DNA在90695c变性，再迅速冷却至40s60C,弓I物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70s 75C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短 靶基因（长度为100300bp时） 可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94c变性，65c左右退火 与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活 性）。2 .循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在 30s40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出 正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。三、PCR结果异常分析PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大