天然蚕丝与丝素蛋白多孔膜的生物降解性研究

1、天然蚕丝与丝素蛋白多孔膜的生物降解性研究2007年第65卷第22期.25922596化学ACTACHIMICASICAVo1.65,2007No.22,25922596?研究论文?天然蚕丝与丝素蛋白多孑L膜的生物降解性研究黄训亭邵正中木陈新(复旦大学高分子科学系教育部聚合物分子工程重点实验室上海200433)摘要较为详细地研究了经不同条件处理的丝素蛋白多孔膜材料和天然蚕丝在蛋白酶作用下的降解性能以及降解前后材料的微观形貌和结构的变化.结果表明,丝素蛋白材料中不同结构(构象)的含量是影响其降解速度的一个重要因素.对于由再生丝素溶液所制备的材料,调控其中SilkII结构(折叠构象)的比例可能是控制

2、丝素蛋白材料降解速度的有效途径.关键词丝素蛋白多孔膜;天然蚕丝;生物降解;折叠;蛋白酶InvestigationontheBiodegradationBehaviorofBombyxmoriSilkandPorousRegeneratedFibroinScaffoldHUANG,XunTingSHAO,ZhengZhongCHEN,Xin(EducationMinistryKeyLaboratoryofMolecularEngineeringofPolymers,DepartmentofMacromolecularScience,FudanUniversity,Shanghai200433)A

3、bstractBombyxmorisilkandporousregeneratedfibroinscaffoldwithdifferenttreatmentsweredegradedinvitrobyaprotease.Thequantitative,morphologicandstructuralchangesofthematerialswereevaluated,showingthattheconformationalcontentwasaveryimportantfactortoaltertherateofdegradadonintheprocess.Funhe肿ore,forthere

4、generatedfibroinmaterials,adjustingthecontentof一sheetwasallefficientmethodtocontroltherateofdegradation.Keywordsporousregeneratedfibroin;Bombyxmorisilk;biodegradation;8一sheet;protease蚕丝是最早被利用的天然蛋白质之一,人类利用蚕丝作为织物的历史已有五千多年.近年来蚕丝因其优异的力学性能和良好的生物相容性使它在生物医药等高新技术领域日益受到重视,丝素蛋白作为手术缝合线,组织工程以及药物缓释材料的报道也日益增q】.作为

5、生物医药材料,其生物降解性是一项很重要的性能指标.例如,组织工程中的支架材料,不仅要求生物相容性好,更希望其降解速度与组织的再长速度相匹配,方可达到良好的修复效果【5】.因此,如何能够控制丝素蛋白材料在体内的降解速度是许多研究者关心的问题.由于天然蚕丝在植入人体内60d以后仍保留50%以上的力学性能,根据通常人们对"可降解"材料的定义,蚕丝不属于可生物降解的材料【2.6】.但随后的研究证明,蚕丝作为一种蛋白质,是可以被某些酶降解,并且植入人体内也会最终被吸收,只是所需要的时间比一般意义上的可降解材料要长2,71.影响材料降解性能的因素有很多,如材料的结构,形态,降解条件,生

6、理化学环境等2.8.9,只有对降解的过程,机理,影响因素等有充分的了解,才能达到有效控制材料降解行为和降解速度的目的.目前国内外对丝素蛋白材料降解方面的工作相对较少6.1.1",因此有必要对其进行更深入的研究.我们曾对丝素蛋白构象及其在各种外源性因素影响下的转变等方面进行了大量的探索11,并利用这些结果制备出丝素蛋白多孔膜15.而另一方面,我们的E-mail:.on;FaxReceivedAl2,2007;revisedJuneI,2007;acceptedJuly8,2007.国家自然科学基金(Nos.20434010,20

7、525414)和上海市科委(No.05JC14009)资助项目NO.22黄训亭等:天然蚕丝与丝素蛋白多孔膜的生物降解性研究2593探索性实验表明,淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶对丝素蛋白膜的降解作用非常强(膜在1d内全部溶失),而灰色链酶菌蛋白酶对蚕丝的影响却很小(15d内丝几乎没有变化).本文分别对丝素蛋白多孔膜/灰色链酶菌蛋白酶体系和天然蚕丝/淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶体系的生物降解性进行了研究通过研究丝(蛋白多孔膜)材料中的构象含量对降解速度的影响,证明调节其中的SilkII构象含量是调控材料降解速度的一种有效途径,以此希望为动物丝及丝素蛋白材料在生物医药领域的应用提供有用信息.1实验部分1.1丝素

8、蛋白材料的制备将蚕丝于质量分数w=0.5%碳酸氢钠的沸水中脱胶45min,用大量清水洗涤以除尽丝胶,65烘干.取适量干燥好的脱胶蚕丝溶于饱和溴化锂溶液中并使用截留分子量为1200014000Da的半透膜于去离子水中透析3d.透析完全的溶液经离心机6000r/min离心,取上清液,将溶液浓缩至质量分数w=10%【l.加入适当的醇类变性剂经过冷冻干燥得到多孔膜1.将多孔膜于乙醇溶液中进行不同程度的后处理,去离子水洗涤后冻干备用.1_2降解体系实验中使用两种蛋白酶,分别为灰色链酶菌蛋白酶(Sigma公司)和淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶(广州裕立宝生物科技有限公司).将蛋白酶溶解于pH=7,浓度为0.05m

9、ol/L的磷酸盐缓冲溶液中得到降解用酶溶液,经过蛋白酶活性测定(国家标准SB/T103171999),所用灰色链酶菌蛋白酶溶液的活力为60u/mL,淀粉芽孢杆菌蛋白酶溶液的活力为80u/mL.降解温度恒定为37.在规定的时间点取出一组样品(每组为3至5个平行样品),同时更换酶溶液,以保证酶溶液的活力.实验中准备一份样品置于不加酶的缓冲溶液中作对比.将取出的样品用去离子水充分洗涤,干燥称重,以备后续测试所用,同时可根据下式计算样品的失重百分率.样品失重百分率:)二×100%其中为降解后样品重量,为降解前样品重量.1.3样品测试1.3.1固体核磁共振将冷冻干燥的多孔膜粉碎后装入样品管内,

10、采用VarianInfinityPlus一300固体核磁共振仪(美国瓦里安公司)检测,得到交叉极化魔角旋转C固体核磁共振谱(GPMAS).其中C观测频率为75.39MHz,样品管旋转速率为9kHz,C射频功率和H去偶功率均为62.5kHz,脉冲技术接触时间为1.0ms,脉冲重复时间为2S,扫描积累数大于50扫描电子显微镜(SEM)将丝素蛋白材料在液氮中脆断后用导电胶固定于样品台,经喷金后采用TS5136MM扫描电子显微镜(捷克TESCAN公司)观察其表面和断面的形貌.1.3.3X射线衍射仪(XRD)采用X'PertPROX射线衍射仪(荷兰帕纳科公司)测定材料的广角x射线衍

11、射图谱,铜靶,管电压40kV,管电流40mA,扫描速度0.1(.)/s,扫描范围o60.2结果与讨论2.1丝素蛋白多孔膜的酶促降解按照我们的方法制备所得到的丝素蛋白多孔膜在磷酸盐缓冲液中仅有少量的失重,而且这样的失重随着作用时间极其缓慢地增加,经过130d失重也不超过15%.但多孔膜在灰色链酶菌蛋白酶溶液中则有明显的失重(图1):置于酶溶液中的第一天,多孔膜的失重就达到10%,之后随着蛋白酶作用时间的增加,多孔膜的失重稳步增大,18d后失重近70%.呈'g言蓦娄051015202530501oo150Degradationtime/d图1各种不同处理条件下的丝素蛋白多孔膜在缓冲溶液和灰

12、色链酶菌蛋白酶溶液中的失重曲线插图是前5d失重曲线的放大Figure1QuantitativechangeofporousregeneratedsilkfibroinwithvarioustreatmentsTheinsertedillustrationzoomsinthef'wst5d.:porousfibroinwithoutethanoltreatedinproteasefromStreptomycesgriseces;:porousfibrointreatedbyethanolfor20dinproteasefromStreptomycesgriseces;:porousfib

13、rointreatedbyethanolfor45dinproteasefromStreptomycesgriseces;:porousfibroinwithoethanoltreatedinphosphatebuffer加2594化学,oI_65.20o7图1中还列出了多孔膜经过20d乙醇后处理和45d乙醇后处理的失重曲线.从图中可以看到,经过乙醇后处理,多孔膜在酶溶液中的失重速率减慢,其在缓冲溶液中前10d基本不发生变化,随后才开始发生极少量的失重.未经乙醇处理的多孔膜在酶溶液中,其首日的失重就达到10%以上,而经过处理后多孔膜首日的失重在5%左右.之后两种膜的失重速率相差不是很大,但相比

14、于未经过后处理的膜,乙醇后处理使多孔膜失重50%的时间点由原来的15d略微延长到18d及以上.无论是否后处理,这些多孔膜经过2030d的时间最终都能完全溶失.对原始的丝素蛋白多孔膜和经过乙醇溶液处理45d后的样品进行NMR测试,并将它们核磁图谱中的一丙氨酸C8峰进行解析拟合【l卜(图2),结果表明:未经后处理的多孔膜本身含有较大量SilkII的结构(折叠),约为47%,这也可以解释为何此类多孔膜在水溶液和缓冲液中的失重相对较小;乙醇处理45d后,丝素多孔膜的结构发生了一定的变化,其中Silk的结构有限地增加至61%左右.这可能是因为乙醇的作用主要由材料的表面开始,使其形成更为致密的结构,进而阻

15、碍了材料内部的进一步构象转变.26242220】8】614】2102图2原始丝素多孔膜(A)和45d乙醇后处理丝素多孔膜(B)的CCP-MAS核磁谱Figure2CCP-MASNMRectrumofporousgeneratedsirfibroinbef0reeanoltreated(A)andafter45days'eanoltreated(B)众所周知,丝素蛋白形成膜状材料后,主要含有两种结构,分别是SilkI和SilkH2o.其中SilkI的构象规整性相对较差且不稳定,容易被破坏;而SilkII结构主要是由反平行的折叠链堆砌而成,具有很好的规整性,在丝素蛋白的各种构象中最稳定【2

16、".本实验选择的两种酶都是非特异性蛋白酶,对底物有很广的进攻位点10,22,因此可以反映底物的整体规整性和结构对其降解速度的影响.本文所制备的原始丝素多孔膜因其本身的Silk结构较多,在缓冲溶液中的溶失率相对较小.经过乙醇调节,SilkII的构象含量又有相应的提高,使膜的耐缓冲溶液和耐酶降解性均有所增强,尤其是在降解的初始阶段,这种效果更为明显.如前所述,由于乙醇后处理的局限性,其对膜结构的改变主要集中在表面,因此材料表面的疏水性和SilkII结构的含量都会增加,但是这种后处理对多孔膜整体中SilkII结构含量提高的贡献相对有限,我们在核磁分峰拟合图(图2)中看到,即便是经过45d处

17、理,SilkII构象也只提高了约14%.所以,丝素蛋白多孔材料在最初的降解程度减少的较为明显.因此,我们认为提高SilkII结构在多孔膜中的含量可以减缓丝素蛋白材料的降解速度,进而提高其耐降解性能.如果能够很好的调控材料中Silk结构的含量,就有可能达到控制材料降解速度的目的,使丝素蛋白材料在医药领域的应用更具前景.将缓冲溶液和酶溶液处理前后的多孔膜小心地用去离子水洗净,采用扫描电镜观察膜的表面和断面形貌(图3,多孔膜是否经过乙醇处理并不影响其降解后的形貌).从图中可以看到,与初始的丝素蛋白多孔膜相比(图3A和3B),在缓冲溶液中放置20d以上的多孔膜表面形态(图3c)和断面形态(图3D)几乎

18、没有变化,而在酶溶液中的多孔膜表面形态则有极大的改变:随着作用时间的延长,其表面的孔洞界限迅速被破坏(图3E),而后表面堆积起许多降解的碎屑,到最后完全分辨不出多孔结构r图3F).断面形貌的改变相对比较缓慢,起初只是孔洞逐渐变大(图3G),到最后断面的孔结构也被严重破坏,膜的整体结构逐渐崩塌,但在小心取得的残存膜上仍可隐约辨出残留的多孔结构(图3H).2.2天然蚕丝的酶促降解天然蚕丝因为其规整的分子链结构和高度的取向性,在通常的条件下极难降解.但在合适的蛋白酶作用下,蚕丝纤维还是会失重,并缓慢地降解.因为淀粉液化芽孢杆菌对丝素蛋白的降解作用较灰色链酶菌更为显着,所以本实验使用前者进行蚕丝的降解

19、.No.22黄训亭等:天然蚕丝与丝素蛋白多孔膜的生物降解性研究2595一一图3再生丝素多孔膜降解前后表面和断面形貌的改变Figure3MorphologicchangeofporousregeneratedsilkfibroinbereandafterenzymaticdegradationAsurface.beforedegradation;Bcmss-section,beforedegradation;C-surface,inphosphatebufferfor20d;Dcmss-section,inphosphatebufferfor20d;E-surface,inproteasefor

20、1d:Fsurface,inproteasefor15d:G_cross?section,inproteasefor1d:Hcmss-section,inproteasefor15d实验中采用了两种天然蚕丝,一种是工业上使用的经过加捻的蚕丝,另一种是由蚕茧上直接剥离的蚕丝.二者在淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶作用下的失重过程均可分为两个阶段(图4):前20d是第一阶段,失重相对比较缓慢;20d以后是第二阶段,失重速率开始小幅提高.工业用的蚕丝因为经过加捻,可供蛋白酶进攻的缺陷点相对少,失重速率较慢且样品间弥散性较小;而天然蚕茧丝因暴露在酶溶液中的缺陷点相对较多,且随机取得的丝段之间的差异性可能较大,所

21、以失重快且样品间的弥散性大.我们知道,未经过降解的天然脱胶丝表面是致密而1oo8o604020O05101520253035Degradationtime/d图4天然蚕丝在淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶中的失重曲线Figure4QuantitativechangeofthesilkfiberliecocoonsilkinproteasefromBacillusamyloliquefaciens;:industrysilkinproteasefromBacillusamyloliquefaciens;V:cocoonsilkinphosphatebuffer;:industrysilkinphospha

22、tebuffer光滑的,但是因为蚕吐丝的8字型动作,使天然蚕丝在沿长轴方向存在许多缺陷点(即非结构规整部分)ll】.经过酶的降解作用,蚕丝的表面不再光滑如前,而是变得粗糙,出现很多剥离出微纤的痕迹(图5A).而作为空白样品浸渍在磷酸盐缓冲溶液中的蚕丝则保持了原来光滑的表面形貌(图5B).从蚕丝降解的微观形态上,我们推测蛋白酶很可能先进攻蚕丝上的缺陷点,因此这些缺陷点处的形貌被破坏的相当严重(图5C),蚕丝的微纤也渐渐游离出主体,降解液中出现大量肉眼可见的细纤维,我们将这些细纤维小心收集,冻干后观察形貌,发现这些细纤维的直径范围在510m(小于单根蚕丝纤维的直径),表面同样比较粗糙(图5D).图

23、5天然蚕丝经过降解表面形貌的改变Figure5SurfacemorphologyofthesilkafterdegradationA,C,DnproteasefromBacillusamyloliquefaciens;Binphosphatebuffer2596化学Vo1.65.20o7前人的研究发现,天然蚕丝的结晶形态主要有两种:SilkI和Silk【2'J,二者在x射线衍射图谱中具有不同的衍射峰,其中20=9.1.(0.97nm)和20=20_3.(0.44am)都是典型的SilkII结构,2.我们将降解前后的蚕丝进行x射线衍射测试,从图6可以看出,经过酶的作用,蚕丝中几个典型的结

24、晶峰变得更为清晰,相对强度也有所增加.说明在蛋白酶作用的过程中,蚕丝中结构规整性相对差的部分成为酶优先进攻的位点,并游离出蚕丝主体,致使降解后的蚕丝具有更好的规整性.这和之前我们通过微观形貌观察所得到的结果一致.O1O2O3o4o5O6oDiffractionangle20/(.)图6天然蚕丝降解前后XRD谱图Figure6X-raydiffractioncurvesofthesilkbefore(A)andafter03)degradation3结论在适当的条件下(如蛋白酶的作用等),天然蚕丝和再生丝素蛋白制备的材料经过不同的时间都可以被最终降解;而另一方面,降解的速度与材料的结构和构象含量

25、有密切的关系.蚕丝因其高度的规整性和大量Silk结构的存在而不易降解,对于规整性相对较差的膜材料,SilkII结构的增加对减缓材料的失重速率有明显的作用.反之,如果减少材料中SilkII结构的含量,材料的失重速率将会大大加快.因此,控制材料中SilkII结构的含量,是调节材料降解速度的一种有效手段.References1245Shao,Z.Z.:VoUrath,F.Nature2o02,418,741.Altman,G.H.;Diaz,F.;Jakuba,C.;Calabro,T.;Horan,R.L.:Chen,J.S.;Lu,H.;Richmond,J.;Kaplan,D.L.Bioma-

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