MS培养基及配制注意事项

1、MS培养基母液的配制 母液 成分 规定量 浓缩 倍数 称取量 (mg) 母液 体积 (ml) 配制1升 培养基吸 取量定容 编 号 种 类 1 大 量 元 素 KNO3 1900 10 19000 1000 100 NH4NO3 1650 10 16500 MgSO4- 7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 2 CaCl2 2H2O 440 10 4400 1000 100 3 微 量 元 素 MnSO4- 4H2O 22.3 100 2230 1000 10 ZnSO4- 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83

2、100 83 Na2MoO4 - 7H2O 0.25 100 25 CuSO4.5H2O4 0.025 100 2.5 CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 铁 盐 Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 FeSO4.4H2O 27.8 100 2780 5 有 机 物 甘氨酸 2.0 100 100 500 10 盐酸毗哆醇 0.5 100 25 盐酸硫铉素 0.1 100 5 烟酸 0.5 100 25 6 肌酸 100 100 5000 500 10 注意：1 .大量元素按照使用时高 10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除 CaClCaCl2

3、2H2H2O O单独配制夕卜，其余化合物混合在 500ml烧杯中加适量蒸储水溶解，用玻璃棒搅 拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸储水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合 物名称(或编号)，浓缩倍数，配制日期和配制者姓名， CaCl22H2O配制同上置于另一小口 瓶中。 2.微量元素母液的配制 按要求浓缩 100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐( FeSO4 7H2O和 Na2-EDTA.2H 2O)作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸储水溶解后， 定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。 3.铁盐配制将 FeSO4 7H2O和Na2-EDTA.

4、2H 2O分别溶于450ml蒸储水中，加热，（很重要） 不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4 .有机物母液配制，按母液要求浓缩 50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量 后，溶解，定容在 500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。 5. 母液最好在 24C的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液 最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。 1. 制备母液和营养培养基时，所用蒸储水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是 高纯度的（分析纯）。 2. 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专

5、用一药匙。 .生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制 培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，荼乙酸（ NAA ），呵噪乙 酸（IAA ），赤霉素（GA3）, 2, 4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然 后加水，如溶解不完全再加热。激动素（ KT）和6-节基喋吟（BA）可溶于少量1mol/L的 盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在 100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生 长调节物质0.5mg,配制后一般要求在低温（

6、04C）保存，配制培养基时如每升（1000ml） 需添加的生长调节剂物质为 0.5mg时，则取1ml母液即可。 二、培养基配制和灭菌 一. 养培养基配制程序 （一）.母液吸取量的计算 配制培养基的升数 公式1:母液吸取量=母液体积（CC） X - 母液浓缩倍数 培养基要求的含量 - （各种生长调节剂） 母液每CC的含量 （二）各种母液按顺序编号排列 A.大量元素；B.CaCl2.2H2O ； C.微量元素 ；D.铁盐； E.有机物； F.生长素荼乙酸（NAA：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸储水定容至 1000ml; G.细胞分裂素、激动素（KT

7、）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后，加蒸储水定容至100ml。 （三）配制培养基（1000ml） 1. 琼脂：称取57g琼脂，加入300ml蒸储水，加热溶解直至完全溶解为止 . 2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替， 称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸储水中。 3. 各种母液的吸取（培 养基 1L） 公式2:母液吸取量 （1） 用50ml量筒量取大量元素母液（ A）和CaCl2 2H2。母液（B）各100ml （2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（ C），铁盐（D）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（ H） 10ml （4

8、） 移取激素 将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至 80 C左右，用酸度计 或精密PH试纸测定培养基的 PH 一般要求5.86.0，过酸过碱则用 1N NaoH和1N HCL调 整。 二. 分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基， 1000ml培养基分装到25-30个三角瓶 中，每个三角瓶约 30ml左右（一般占试管、三角瓶容量 1/41/3左右）注：培养基勿碰瓶 壁。 三. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。 用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水 洗涤干净，然后按次序放回原处。 三、高压蒸汽灭菌锅的使

9、用方法 具体操作步骤： 1. 高压锅放水至平把架； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅 ； 3. 盖上热压锅盖，上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀. 4. 然后接通电源. 5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀，排除冷空气（此步很重要）。 6. 排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到 0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间， 具体方 法：当压力锅指针升至 0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至 0.11MPa时接通电源，不断 重复此操作过程，维持 20分钟。 7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完 全排除后，打开热压灭菌锅盖 （注意

10、对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出。 8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无 微生物污染，可将培养基置于25 C下保存4 天,如果培养基需要贮存较长时间， 可在4C低 温下保存。 灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操 作的步骤都很相近。 进水放进培养基盖紧锅盖 r 关上放汽阀 r 检查安全阀 r 接上加热源 r 待压力升至 0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀0.11MPa（121 C）下灭菌2025分钟，保持稳定压力 除热源逐渐打开放气阀锅内空气排除完后开放锅盖稍冷后取出培养基。 四、无菌操作技术 （一

11、）植物材料表面消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料， 都不同程度地带有各种微生物。 这些污染源一旦带入培养基， 便会造成培养基污染。 因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作手续接到 上，这一过程叫做接种。 1. 接种步骤： 第一步：清理材料 rr 流水冲洗 rr 加入吐温（或洗衣粉）清洗 rr 自来水冲洗 第二步：对材料的表面浸润灭菌 ：70%酒精浸10-30秒-无菌水 第三步：灭菌剂处理 r 0.1-1%升汞5-8 min （或其他灭菌剂） 第四步：无菌水进行冲洗 注意事项： 1.1. 灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存. 2 .对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌

12、水冲洗3 -4次，升汞一般5 -8次，每次不少于3 min 3 .灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底. 4 .灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。 5 .灭菌液要充分浸没材料 2.2. 无菌操作可按以下步骤进行： (1) 在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前 3小时打开其内紫外线灯进行杀菌； (2) 在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯； (3) 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； (4) 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面； (5) 先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镶子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复

13、过火尖端 处，对培养皿要过火烤干； (6) 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； 材料吸干后，一手拿镶子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。(如叶片切成0.5cm2 的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含 1-2片叶原基)在接种过程中要经常 灼烧接种器械，防止交叉污染。 (7) 接种完毕后要清理干净工作台， 可用紫外线灯灭菌 30分钟，若连续接种，每 5大要大 强度灭菌一次。 常用植物激素 类别 名 称 缩写词 分子量 使用浓度范围 母液配制 说明 生 2, 4一二氯苯氧乙酸 2, 4- D 221.0 0.001 - 10mg/L 生长素通常 用NaO

14、H溶 IAA易被植物 细胞所氧化。 长 素 a 一蔡乙酸 NAA 186.2 0.001 - 10mg/L 液滴至溶解 成溶液。 能溶于乙醇 故培养基中很 少单独使用。 呵噪一3一乙酸 IAA 175.2 0.001 - 10mg/L 呵噪一3一丁酸 旧A 203.2 0.001 - 10mg/L 细 6一节基氨基喋吟 BA 225.2 分裂素通常 能溶于稀 玉米素不耐 热，不能高压 胞 分 6-糠基氨基喋吟 KT 215.2 NaOH ,含水 乙醇或稀盐 灭菌。 裂 N一异戊烯氨基喋吟 (玉米素) ZT 219.2 酸 赤 霉 素 赤霉素 GA3 346.4 能溶于乙醇 不耐热不能高 压灭菌

15、在愈伤 组织和悬浮培 养物的启动和 保持生长时才 需要有时小植 株再生时也需 要 四、常用药品的配置方法 1.1mol/L HCl1mol/L HCl的配制：根据盐酸的密度 37%盐酸溶液的密度为 1.19克/毫升，假设要配制 1000ml 1mol/L HCl1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为 1mol1mol，所以需要量取 37%37%的盐酸为 1*36.5/37%/11*36.5/37%/1.19=82ml.19=82ml 2.1mol/L1mol/L的NaOHNaOH的配制：称40gNaOH，然后融于1000ml的蒸储水中。（定容到100ml） 3.95%95%的酒精配制成 75%75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸储水即可 得到75%的酒精。 如果用无水酒精配制 75%的酒精，则量取 750ml的无水酒精，再加水 250ml。 4.0.1%0.1%的升汞配制：先称取1克升汞粉