基因工程第二章

1、第二章第二章 工具酶工具酶第一节 限制性内切酶 基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。 一、寄主限制与修饰体系（一、寄主限制与修饰体系（R/MR/M体系）体系）20世纪60年 W.Arber、H.Smith 和D.Nathans 等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖(B)修饰E.coli KE.coli B(K)修饰(限制)10- 4(限制)10- 411R/MR/M定义：定义：R/M中的限制作用（restri

2、ction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏 限制与修饰与三个连锁基因有关 hsd R编码限制性核酸内切酶 hsd M编码产物是DNA甲基化酶 hsd S表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。寄主的限制与修饰有两个方面的作用 1、保护自身的DNA不受限制，2、破坏外源DNA使之迅速降解。 细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身 DNA 与外源 DNA 的。二、限制

3、性内切酶二、限制性内切酶( (RE)RE)限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。EcoR切割位点 分类 酶分子的结构与功能三亚基多功能酶单一功能酶二亚基双功能酶限制与修饰的新闻系酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制与修饰的辅助因子ATP Mg2+ SAM(S-腺苷蛋氨酸） Mg2+ATP Mg2+ SAM(S-腺苷蛋氨酸）识别序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称序列特异性，非对称序列切割位点特异性位点5端至少1000bp在识别序列内部或附近距特异性位点3端24-26bp处切割方式随机切割特异切割

4、特异切割1 1、 类类RERE（1）.命名 主要内容是: 基本名称 有机体属名的第一个字母 ( 大写 ) 和种名的前两个字母 ( 小写 ), 组成酶的菌株 第一个字母加在基本名称之后 ; 大写字母表示酶的编码基因为染色体外遗传成分。发现次序 罗马数字表示系统名称 RE为R, 甲基化酶为 M ,通常省略例如 R-HindIII表示限制性核酸内切酶 , 相应的甲基化酶用 M- HindIII 表示。 但在实际应用中 , 尤其是在上下文已交代得很清楚时 , 限制性内切酶的系统名称 R 常被省略。HindIII H = genus Haemophilus in = species influenzae

5、 d = strain Rd III = third endonuclease isolated2.2.识别序列识别序列A 一般识别序列为4-8bp，大部分为双重旋转对称的回纹结构，即一条5- 3与另一条为3- 5的碱基相同 B 在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。 EcoR 可切割 CAGG CCGG 内部简并 CTGG Xho 可切割 R GATCY 外部简并 Y ： T或 C R ：A或G简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率 C C 同裂酶同裂酶isoschizomers)isoschizomers)指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶 切割位置

6、相同 Hind III 和 Hsa I 均 A AGCTT 切割位置不同 Xma I C CCGGG Sma I CCC GGG甲基化影响同裂酶是否切割 Msp I Hpa 为同裂酶 当识别序列CCGG的第二个C甲基化后 Hpa 就不能切割了 D D 同尾酶同尾酶 同尾酶（isocaudamer）来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。BamH G GATC,Bcl T GATC，Bgl AGATC,Sau3A GATCXho R GATC就是一组同尾酶 由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用。3. 3. 类限制性内切酶的切割方式

7、及意义类限制性内切酶的切割方式及意义（1）三种切割方式 A 从识别序列中间切开产生平末端（blunt end) B 从5-3链上对称轴左方切开和3-5链上对称轴右 方切开形成具有凸出的5磷酸基团的粘性末端C C 从从5 5-3-3链上对称轴右方切开和链上对称轴右方切开和3 3-5-5链上对称轴链上对称轴 左方切开形成具左方切开形成具有凸出的有凸出的3 3羟基基团的粘性末端羟基基团的粘性末端有些限制性核酸内切酶的识别序列为间断型回文结构 , 酶的切点定位于核昔酸 N 中 , Bgl I(GCCNNNN NGGC) 、 Nde I (C TNAG) 、 Sfi I (GGCCNNNNN NGGCC

8、) Xmn I (GAANN NNTTC) 等。 有极少数 型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列 , 如 Mbo 识别 GAAGA 序列 , 切割位点则是 : 5-GAAGANNNNNNNN N-3 3 -CTTCT cmNNNNNN N -5 这种切割位点大都出现于非回文型序列的酶之中。一些一些RERE及其切割序列及其切割序列 粘性末端意义：粘性末端意义： A A 用相同内切酶切割后的片段能在用相同内切酶切割后的片段能在5 5端端靠碱基配对将单链重叠成双链。促使不同的靠碱基配对将单链重叠成双链。促使不同的DNADNA分子相连，或使一个分子相连，或使一个DNADNA片段首尾相连片段首尾相连

9、而自身环化。而自身环化。B B 处理处理DNADNA片段时，不同酶消化产生的片段时，不同酶消化产生的DNADNA末端往往起到不同的作用末端往往起到不同的作用 凸出的5磷酸基团易进行同位素标记，凸出的3羟基易进行同聚物加尾粘端补为平端 G AATTC G GAATT CTTAA G CTTAA CTTAA粘端变为平端 CTGCA G G G G ACGTC ACGTC C EcoR I DNA多聚酶PstIT4DNA聚合酶 4. 4. 型型RERE的反应条件的反应条件(1 ) 标准酶解体系的建立 一个单位的限制性核酸内切酶定义为 : 在合适的温度和缓冲液中 , 在 20 L 反应体系中 ,1h

10、完全降解 1 g DNA 所需要的酶量。（2 2）酶解过程）酶解过程1. 酶解体系2. 混 匀3. 反应终止4. 酶解结果鉴定（2 2）酶解过程）酶解过程 酶切反应体系 质粒DNA 1.5l10 MC buffer 2.0lBamH 0.2l BSA 0.1lddH2O to total 20.0lRE RE 酶切反应的终止酶切反应的终止 65 5min 使大多数RE钝化。 对不易印钝化的需特殊方法，如加SDS或尿素，但两者不易从DNA中去除。需抽提才可以。（方法同DNA提取的抽提）5.5.影响影响RERE活性的因素活性的因素（1）DNA纯度 DNA制剂中，Pro. 酚，氯仿，酒精，EDTA

11、，高盐浓度等，影响RE的活性。提高酶切效率方法：1.增加RE用量 100U/l2.扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释3.延长酶切时间（2）DNA甲基化程度 甲基化作用会强烈影响酶活性。基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的 。 不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源 的细胞类型有密切关系。 用处： 1. 改变RE的识别序列的特异性。 2.酶切前保护内部识别位点（3）酶切反应温度 不同RE具有不同的最适反应温度 一般为37 也有例外 如 SmaI 25 ApaI 30 高于可低于最适反应温度会导致酶失活（4）DNA分子结构 超螺旋比线性DNA需酶量大，最高可达20倍 另外切割于不同D

12、NA部位的限制位点时，效率也不同，但最多不会相差10倍（5）RE 的缓冲液 缓冲液组分包括： Mg2+； Tris-Hcl 使pH处于最佳数值范围内 保护酶稳定性的物质 -巯基乙醇、（DDT) 、（BSA)星号活性：非特适条件（酶浓度高，甘油高、代离子强度，高pH）等常使酶发生不正确切割，切割特异性。5.5.RERE对对DNADNA的消化作用的消化作用（1）限制性内切酶对DNA的局部消化 理论上： 一条DNA分子上4种核苷酸量相等。 NNNN GATC x x x = 1/256 则 6 Base ()6 = 1/4096 8 base ()8 = 1/65,536 则 RE的识别频率为：1/

13、4N N为核苷酸的识别序列的碱基数 即每隔 4N个碱基就切割一次DNA完全酶切消化（complete disestion ) 如果一种RE对DNA分子的切割达到了这样的片段（ 4N）的水平称之为完全酶切消化局部酶切消化（partial digestion) RE 对大量的DNA的消化不进行完全，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物，称这为局部酶切消化（3）RE对真核DNA的消化作用 真核生物基因组大，可达109左右，RE 切后有105_106种不同大小的DNA 片段用普通方法（电泳或液相色谱）无法分析，建基因文库才行。 在某质粒上有四个Hind 的酶切位点用，即用Hind酶应得到3.6、5.

14、3、7.4、和11.4KB的四个片段。但是用Hind切割从被感染的寄主细胞中分离到的该质粒DNA时，只得到3个片段，分别是7.4、8.9和11.4KB，根据你掌握的知识分析可能的原因。 一个线性DNA分子用两种限制性内切酶酶切，结果如下： BamH 8.0， 7.5 ， 4.5， 2.9 kb Bgl 13，6 ， 3.9 kb BamH+ Bgl 7.5 ， 6，3.5， 2.9 ， 2, 1 kb 请画出这个线性DNA的限制酶图谱。623.57.512.9Bgl BamHBamHBamHBgl 连接酶是一种能够催化DNA上裂口两侧（相邻）核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯

15、键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来的酶。二、连接酶 连接过程1.辅助因子裂开后形成酶-腺苷酸（AMP）复合物，2.然后复合物接合到切口上，形成磷酸二酯键，产释放AMP，3.酶-AMP复合物同具有3-OH和5P基团的切口接合，4.AMP同磷酸基团反应，并使其同3OH基团接触，产生新的磷酸二酯键，从而使切口封闭。ATP ppiT4DNA连接酶NAD+NMNE.coliDNA连接酶酶-AMP酶OHPOHAPPAMPDNA连接酶的分子机理535335NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NMN烟酰胺单核苷酸ATP腺苷三磷酸AMP腺苷一磷酸 可连接切口 (nick）或断口(cut)，但不能连接缺口 (gap)

16、 可连接双链DNA 分子的一部分，但不能连接单链 DNA 分子ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5二、二、DNADNA连接酶的种类连接酶的种类大肠杆菌DNA连接酶T4 噬菌体DNA连接酶 1. T4 噬菌体DNA连接酶 T4 噬菌体 DNA 连接酶 ( 又称 T4DNA 连接酶 ) 分子质量为 68Ku, 需要 ATP 作为辅助因子 , 最早是从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。 T4 噬菌体 DNA 连接酶可以连接 : 两个带有互补黏性末端的双链 DNA 分子 ; 两个带有 平头末端的双链 DNA 分子 ; 一条

17、链带有切口的双链 DNA 分子 RNA:DNA 杂 合体中 RNA 链上的切口 , 也可将 RNA 末端与 DNA 链连接。T4DNA连接酶Mg2+ ATP2.大肠杆菌DNA连接酶 大肠杆菌 DNA 连接酶分子质量为 75Ku, 需要 NAD+ 作辅助因子 。大肠杆菌DNA连接酶可连接：两个带有互补黏性末端的双链 DNA 分子 ; 一条链带有切口的双链 DNA 分子。由于对 DNA 末端要求比较严格 , 所以它的连接产物转化细菌后 , 假阳性背景非常低 。大肠杆菌连接酶和T4DNA连接酶异同点异：1.分子量不同 大肠杆菌连接酶相对分子量为75000 T4DNA连接酶相对分子量为68000。 2

18、.辅助因子不同 大肠杆菌连接酶需NAD+为辅助因子 T4DNA连接酶需ATP为辅助因子 3.连接作用不同 T4 DNA连接酶能连接粘性末端和平齐末端，大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端同： 连接时都先产生酶-腺苷酸复合物，然后这种复合物结合到DNA的裂口上，在那里腺嘌呤核苷酰基与裂口外的5P发生反应，产生Ad-p-p-DNA的结构，最终导致DNA的修复。三、连接体系 vector 100.0ng insert 30.0ng 10buffer 2.0l ligase 1.0l ddH2O to total 10.0lPCR仪上16连接过夜。 对于站性末端一般在 l216 之间进行反应 , 平头末端连接 反应可在室温 (30 ) 进行 , 并且需用比粘性末端连接大 10100 倍的酶量。 终止反应可加 入 2 L 0.5mol/L 的 EDTA 或者 75 水浴 10 min一、寄主限制与修饰体系（一、寄主限制与修饰体系（R/MR/M体系）体系）20世纪60年 W.Arber、H.Smith 和D.Nathans 等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖(B)修饰E.coli KE.coli B(K)修饰(限制)10- 4(限制)10- 411R/MR/M定义