第四节双水相萃取技术ppt课件

1、第四节第四节 双水相萃取技术双水相萃取技术一一 、概述、概述 1896年，荷兰微生物学家年，荷兰微生物学家Beijerinck发现聚合物发现聚合物的不相容性的不相容性:把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，得到一种不透明的混合溶液，静置后液混合时，得到一种不透明的混合溶液，静置后分为两相，上相含有大部分水，下相含有大部分分为两相，上相含有大部分水，下相含有大部分琼脂或淀粉，而两相的主要成分都是水琼脂或淀粉，而两相的主要成分都是水. 1955年，瑞典伦德大学的年，瑞典伦德大学的Albertsson初次利用双初次利用双水相技术从单细胞藻类中分别淀粉核，从此开创水

2、相技术从单细胞藻类中分别淀粉核，从此开创了双水相分配技术。了双水相分配技术。 1979年德国年德国GBF的的Kula和和Kroner等等3人将双水人将双水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。程大为改善。 1、根本概念及分类、根本概念及分类 双水相系统双水相系统:某些亲水性高分子聚合物的水某些亲水性高分子聚合物的水溶液超越一定浓度后可构成两相溶液超越一定浓度后可构成两相. 聚合物聚合物-聚合物聚合物-水系统水系统:聚合物分子的空间聚合物分子的空间妨碍作用使相互间无法浸透妨碍作用使相互间无法浸透 聚合物聚合物-无机盐无机盐-水系统水系统:

3、盐析作用盐析作用 为什么会构成双水相？为什么会构成双水相？ 聚合物之间的不相容性聚合物之间的不相容性:聚合物分子的空间妨碍作聚合物分子的空间妨碍作用使相互间无法浸透，从而在一定条件下分为两用使相互间无法浸透，从而在一定条件下分为两相。相。 只需两种聚合物水溶液的水溶性有所差别，混合只需两种聚合物水溶液的水溶性有所差别，混合时就可发生相分别，并且水溶性差别越大，相分时就可发生相分别，并且水溶性差别越大，相分别倾向也就越大。别倾向也就越大。 某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低分子质量某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低分子质量化合物的溶液相混时，只需浓度到达一定值，也化合物的溶液相混时，只需浓度到达

4、一定值，也会产生两相。其构成机理是由于盐析作用。会产生两相。其构成机理是由于盐析作用。 双水相系统分类双水相系统分类 双聚合物体系：聚乙二醇双聚合物体系：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/葡聚糖葡聚糖dextran，Dx；聚丙二醇聚丙二醇polypropylene glycol/聚乙聚乙二醇；甲基纤维素二醇；甲基纤维素methylcellulose/葡葡聚糖等。聚糖等。 聚合物和无机盐体系：聚合物和无机盐体系：PEG/磷酸钾略作磷酸钾略作KPi、PEG/磷酸铵、磷酸铵、PEG/硫酸钠等硫酸钠等 类型类型形成上相的聚合物形成上相的聚合物形成下相的聚合物形成下相的聚合物非

5、离子型聚合物非离子型聚合物/ /非离子型聚合物非离子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮乙烯吡咯烷酮聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、甲基聚丙二醇、羟丙基葡聚糖、甲基聚丙二醇、羟丙基葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖乙基羟基纤维素乙基羟基纤维素葡聚糖葡聚糖甲基纤维素甲基纤维素羟丙基葡聚糖、葡聚糖羟丙基葡聚糖、葡聚糖高分子电解质高分子电解质/ /非离子型聚合物非离子型聚合物羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐聚乙二醇聚乙二醇高分子电解质高分子电解

6、质/ /高分子电解质高分子电解质葡聚糖硫酸钠葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠非离子型聚合物非离子型聚合物/ /低分子量化合物低分子量化合物葡聚糖葡聚糖丙醇丙醇非离子型聚合物非离子型聚合物/ /无机盐无机盐聚乙二醇聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸磷酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、酒石酸钾钠、甲酸钠钠、酒石酸钾钠、甲酸钠与普通的水与普通的水-有机溶剂体系相比较有什么不同？有机溶剂体系相比较有什么不同？ 双水相体系中两相的性质差别如密度和双水相体系中两相的性质差别如密度和折射率等较小。由于折射率的差别甚小，折射率等较小。由于折射率

7、的差别甚小，有时甚至都难于发现它们的相界面。两相有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小，仅为间的界面张力也很小，仅为10-510-4 N/m普通体系为普通体系为10-3210-2 N/m。 2、双水相萃取技术的根本特点、双水相萃取技术的根本特点 两相的性质差别如密度和折射率等较小两相的性质差别如密度和折射率等较小 两相间的界面张力也很小两相间的界面张力也很小 一条件温暖，体系具有生物亲和性一条件温暖，体系具有生物亲和性二所需溶液少，操作方便二所需溶液少，操作方便三分别迅速，步骤简便三分别迅速，步骤简便四操作易于控制四操作易于控制五可简化分别步骤五可简化分别步骤 六能进展萃取性的

8、生物转化六能进展萃取性的生物转化七亲和萃取亲和分配可大大提高分配系数和七亲和萃取亲和分配可大大提高分配系数和萃取专注性萃取专注性 八易于工艺的延续化消费八易于工艺的延续化消费 二、二、 双水相分配原理及其实际根底双水相分配原理及其实际根底一双水相系统分配原理一双水相系统分配原理 能否会构成双水相，取决于混合熵增和分子间作用能否会构成双水相，取决于混合熵增和分子间作用力两个要素。力两个要素。混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力那么混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力那么随分子量的变大而加强。随分子量的变大而加强。当两种高分子聚合物之间互不相溶时，由于相对分当两种高分子聚合物之间互不相溶时

9、，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵添加相比占主导位置，一种聚合物分子的周的熵添加相比占主导位置，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当到达平衡围将聚集同种分子而排斥异种分子，当到达平衡时，即构成富含两种不同聚合物的两相。时，即构成富含两种不同聚合物的两相。 上、下相的组成取决于两种聚合物如上、下相的组成取决于两种聚合物如PEG/Dx的参与量以及其分子质量的大小。的参与量以及其分子质量的大小。 当物质进入双水相体系后，由于外表性质、当物质进入双水相体系后，由于外表性质、电荷作用和各种作用力如憎水键、氢键电荷作用和各种

10、作用力如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响，使其和离子键等的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。在上、下相中的浓度不同。 分配系数分配系数 K不同而分别不同而分别相图相图 双水相构成条件和定量双水相构成条件和定量关系可用相图表示。关系可用相图表示。 双结点线：把均相区和双结点线：把均相区和两相区域分隔开。两相区域分隔开。 系线：衔接双结点线上系线：衔接双结点线上两点的直线。两点的直线。 临界点：当系线长度趋临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的向于零时，即在图中的K点，两相差别消逝，点，两相差别消逝，任何溶质在两相中的分任何溶质在两相中的分配系数均为配系数均为1，成为单，成为

11、单相体系。相体系。KPi质量分数质量分数/%PEG质质量量分分数数/%MTBMVVBT 在同一条系线上的各点分成的两相具有一在同一条系线上的各点分成的两相具有一样的组成，但体积比不同。样的组成，但体积比不同。 当上下两相间密度差小时，两相的体积近当上下两相间密度差小时，两相的体积近似服从杠杆规那么。似服从杠杆规那么。MTBMVVBT二双水相中的分配平衡二双水相中的分配平衡 溶质在双水相中的分配系数也用溶质在双水相中的分配系数也用K=cT/cB表示。表示。 分配系数是各种相互作用的和分配系数是各种相互作用的和. lnKP=lnKE+lnKS+lnKA 总分配系数总分配系数KP: lnKE、lnK

12、S、lnKA分别为静电分别为静电作用、疏水作用、亲和作用对溶质分配系数的奉作用、疏水作用、亲和作用对溶质分配系数的奉献。献。 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成一样而体积不同的两相，在同一条系线上的不成一样而体积不同的两相，在同一条系线上的不同点，物质的分配系数一样。同点，物质的分配系数一样。 一静电作用一静电作用 lnK=lnKo+FZ/RT Ko为溶质静电荷为零时的分配系数；为溶质静电荷为零时的分配系数；F为法拉第为法拉第常数；常数；Z为溶质的静电荷数；为溶质的静电荷数；为相间电位差。为相间电位差。 荷电解质的分配系数的对数与溶质的净电荷

13、数成荷电解质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比正比. 分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异,同一双同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同 带负电荷的蛋白质在双水相种的分配系数带负电荷的蛋白质在双水相种的分配系数K : K+ Na+ NH4+ Li+ (C4H9)4N+ ClO4- SCN- I- Br- Cl- CH3CO2- F- H2PO4- HPO42- 二疏水作用二疏水作用 普通情况下，蛋白质的外表均存在疏水区，疏水普通情况下，蛋白质的外表均存在疏水区，疏水区所占比外表越大，其疏水性越强区所占比外表

14、越大，其疏水性越强.不同组分由于不同组分由于其外表疏水性的差别使得其各自在上下相中产生其外表疏水性的差别使得其各自在上下相中产生相应的分配平衡。相应的分配平衡。 lnKsHF(RH +B) HF为相间的疏水性差，也称疏水性因子；为相间的疏水性差，也称疏水性因子；RH为为氨基酸的相对疏水性；氨基酸的相对疏水性；B为比例常数。为比例常数。 lnKo=HFHFS HFS蛋白质的外表疏水性蛋白质的外表疏水性. lnK0HF(HFS+HFS) HFS为盐浓度添加引起的为盐浓度添加引起的HFS值增量。值增量。 lnKHF(HFS+HFS)+ FZ/RT 三界面张力作用三界面张力作用 非电解质型溶质在液体中

15、的界面张力的存在使它非电解质型溶质在液体中的界面张力的存在使它呈不均匀分布，并聚集在双水相体系中具有较低呈不均匀分布，并聚集在双水相体系中具有较低能量的一相中。能量的一相中。 非电解质型溶质的分配系数与相间外表自在能差非电解质型溶质的分配系数与相间外表自在能差及溶质的分子量有关及溶质的分子量有关 lnKP=-E/kT-M/RT 溶质的分配系数的对数与其分子量呈线性关系溶质的分配系数的对数与其分子量呈线性关系 同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改动同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改动 四亲和作用四亲和作用 经过一定的方法，将配基衔接在双水相的成经过一定的方法，将配基衔接在双水相的成相物

16、质分子上，就构成了具有亲和性质的双相物质分子上，就构成了具有亲和性质的双水相体系，构成对被分配物质的亲和作用，水相体系，构成对被分配物质的亲和作用，调理待提取物在两相中的分配，从而提高其调理待提取物在两相中的分配，从而提高其分别效果分别效果 过渡金属离子过渡金属离子:Cu2、Ni2、Fe2、Zn2、Co2等是常用的亲和配基等是常用的亲和配基 作用机理作用机理:配位键力、配位键力、-键及静电作用力键及静电作用力 四、影响物质分配平衡的要素四、影响物质分配平衡的要素 除了静电作用、疏水作用及界面张力等各除了静电作用、疏水作用及界面张力等各种相互作用要素外，影响物质在双水相系种相互作用要素外，影响物

17、质在双水相系统中分配的要素主要还有统中分配的要素主要还有: 双水相系统的聚合物组成双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、包括聚合物类型、平均分子量平均分子量) 盐类盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值值) 溶质的物理化学性质溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点包括分子量、等电点) 体系的温度等。体系的温度等。 一双水相中聚合物组成一双水相中聚合物组成当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与无当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与无机盐以不同的浓度混合时，能够存在三种情况：机盐以不同的浓度混合时，能够存在三种情况：a、完全混溶性、完全混溶性(匀相

18、溶液匀相溶液)；b、物理的不相溶性、物理的不相溶性(相相分别分别)；c、复杂的凝聚、复杂的凝聚(相分别，聚合物聚集在同相分别，聚合物聚集在同一相中，纯溶剂一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中水聚集在另一相中) 当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸引并发生复杂的凝聚。它们相互吸引并发生复杂的凝聚。 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性 水溶液中聚合物的疏水性按以下次序递增：水溶液中聚合物的疏水性按以下次序递增：葡萄糖硫酸盐葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖甲基葡萄糖葡萄糖葡萄糖羟丙级葡萄糖羟丙级葡萄糖甲基纤维素

19、甲基纤维素聚乙烯醇聚乙烯醇聚乙二醇聚乙二醇聚丙三醇。聚丙三醇。 二成相聚合物分子量二成相聚合物分子量 对于对于PEG/Dextran所构成的双水相体系中，所构成的双水相体系中，假设降低假设降低PEG相对分子质量，那么生物分相对分子质量，那么生物分子分配于富含子分配于富含PEG的上相中，使分配系数的上相中，使分配系数增大；而降低增大；而降低Dextran相对分子质量，那么相对分子质量，那么分配系数减小。分配系数减小。 对于同种聚合物而言，其疏水性随相对分对于同种聚合物而言，其疏水性随相对分子质量添加而添加子质量添加而添加 假想象在上相获得较高的蛋白质收率，对假想象在上相获得较高的蛋白质收率，对于

20、于PEG聚合物，应聚合物，应(? )它的平均相对分子它的平均相对分子质量质量三成相聚合物的浓度三成相聚合物的浓度 聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为零长度为零,此时分配系数为此时分配系数为1，即组分均匀的，即组分均匀的分配于上下相分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合盐混合物的总浓度增大，系线的长度添加，系统物的总浓度增大，系线的长度添加，系统远离临界点，成相聚合物两相性质的差别远离临界点，成相聚合物两相性质的差别也增大，组分在两相中的分配系数改动。也增大，组分在两相中的分配系数改动。 成相物质的总浓度越

21、高，系线越长，生物成相物质的总浓度越高，系线越长，生物分子越容易分配于其中的某一相分子越容易分配于其中的某一相.其它要素其它要素 1.分配物质的分子量分配物质的分子量 2.盐的种类和浓度盐的种类和浓度 3.pH值影响值影响 4.温度的影响温度的影响 5.通气和搅拌的影响通气和搅拌的影响 M10-4 双水相萃取操作及设备双水相萃取操作及设备 一、一、 双水相系统的选择双水相系统的选择:易于两相的分别易于两相的分别. 根据待分别蛋白质和共存杂质的外表疏水根据待分别蛋白质和共存杂质的外表疏水性、分子量、等电点和外表电荷等性质上性、分子量、等电点和外表电荷等性质上的差别，来选择双水相系统，并确定成相的

22、差别，来选择双水相系统，并确定成相聚合物的分子量及浓度、盐的浓度、聚合物的分子量及浓度、盐的浓度、pH值值等要素以确定最正确的萃取系统。等要素以确定最正确的萃取系统。 对于目的蛋白与杂蛋白的外表疏水性相差对于目的蛋白与杂蛋白的外表疏水性相差较大的体系，可利用盐析等作用原理，经较大的体系，可利用盐析等作用原理，经过提高成相系统的浓度，增大双水相系统过提高成相系统的浓度，增大双水相系统的疏水性，到达目的蛋白与杂蛋白的分别。的疏水性，到达目的蛋白与杂蛋白的分别。 对于目的蛋白质与杂蛋白的等电点不同的对于目的蛋白质与杂蛋白的等电点不同的体系，添加适当的盐，并经过调理系统的体系，添加适当的盐，并经过调理

23、系统的pH值使相间电位差变大，而到达目的产物值使相间电位差变大，而到达目的产物与杂蛋白的分别。与杂蛋白的分别。 PEG/Dx系统系统 高聚物高聚物/盐体系盐体系 新的双水相体系新的双水相体系:外表活性剂外表活性剂-外表活性剂外表活性剂-水体系、双水相胶束体系等体系水体系、双水相胶束体系等体系 二、双水相萃取工艺设计二、双水相萃取工艺设计 目的物应满足以下条件：目的物应满足以下条件： 与原料液中的杂质应分配在不同的相中与原料液中的杂质应分配在不同的相中 在双水相体系中的某一相中的分配系数应在双水相体系中的某一相中的分配系数应相对较大相对较大 双水相系统的上下相应易于分别。双水相系统的上下相应易于

24、分别。 工艺流程工艺流程 目的产物的萃取目的产物的萃取 PEG的循环的循环 无机盐的循环。无机盐的循环。 一目的产物的萃取 1.假设目的产物在上相中的分配系数足够大，那假设目的产物在上相中的分配系数足够大，那么细胞匀浆液中的目的产物可采用一步或两步双么细胞匀浆液中的目的产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。 一步双水相萃取是把生物资料悬浮液和双水相系一步双水相萃取是把生物资料悬浮液和双水相系统混合后，分别上下相，其中下相含有大多数杂统混合后，分别上下相，其中下相含有大多数杂质，而上相再经过超滤操作进展进一步的提纯目质，而上相再经过超滤操作进展进一

25、步的提纯目的产物，同时高聚物一相可以得到回收。的产物，同时高聚物一相可以得到回收。 在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分别出来后，再参与盐使其构成新的双水相体系，别出来后，再参与盐使其构成新的双水相体系，那么富含那么富含PEG的上相得到回收，同时，含有目的的上相得到回收，同时，含有目的产物的盐相经过超滤等操作得到分别目的，而且产物的盐相经过超滤等操作得到分别目的，而且可以经过浓缩可以进展回收再利用。可以经过浓缩可以进展回收再利用。 PEG/盐双水相体系一步或两步萃取流程表示图盐双水相体系一步或两步萃取流程表示图 2.细胞内蛋白质的萃取 双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统的下相，而目的产物分配于上相，同时实现目的产物的部分纯化和细胞碎片的除去，从而节省利用离心法或膜分别法除碎片的操作过程。 假设细胞匀浆液中的目的产物的分配系数较小，那么可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。 三步双水相萃取酶的流程表示图三步双水相萃取酶的流程表示图 二二PEG循环循环 在大规模双水相萃取过程中，成相资料的在大规模双水相萃取过程中，成相资料的回收和循环运用，不仅可以减少废水处置回收和循环运用，不仅可以减少废水处置的