C6放射免疫技术曾霞

1、概念：概念：利用多种标记技术与免疫学技术相结利用多种标记技术与免疫学技术相结合而建立的分析技术体系。合而建立的分析技术体系。特点：高度特异性，高度灵敏性特点：高度特异性，高度灵敏性优点：重复性好、准确性高、操作简便、易优点：重复性好、准确性高、操作简便、易 于商品化和自动化。于商品化和自动化。分类：分类：固相测定，液体测定固相测定，液体测定按标记（示踪）物分类：按标记（示踪）物分类：化学发光免疫技术、金免疫技术等。化学发光免疫技术、金免疫技术等。 是是利用放射性核素可探利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的异性相结合而创建的

2、免疫测定技术。免疫测定技术。同位素同位素一、放射性核素一、放射性核素射线：主要为射线：主要为131131I I、125125I I、5757CrCr和和6060CoCo；射线：主要有射线：主要有1414C C、3 3H H和和3232P P。放射性核素的选择原则：放射性核素的选择原则： （1）比活性（首要）。例如）比活性（首要）。例如125I比活性为比活性为1.74104Ci/g，14C比活性为比活性为4.5Ci/g，则，则1mol 125I或或14C结合到抗原上，结合到抗原上，125I的敏感度的敏感度约比约比14C大大3900倍。倍。 （2）合适的半衰期。）合适的半衰期。 （3）易于标记：低

3、能量的）易于标记：低能量的射线易于标记射线易于标记。 因而因而125I是目前常用的是目前常用的RIA标记物。标记物。三、标记物的制备及鉴定三、标记物的制备及鉴定1.标记方法：标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。 （1 1）直接标记法：）直接标记法：是将是将125125I I直接结合于蛋白质侧链残直接结合于蛋白质侧链残基的基的酪氨酸残基或组氨酸残基酪氨酸残基或组氨酸残基上。最常用的是氯胺上。最常用的是氯胺T T直接标记法。直接标记法。优点：优点：操作简便；操作简便；标记物具有高度比放射性。标记物具有高度比放射性。缺点：缺点：只能用于标记含酪氨酸或组氨酸的化合物；只能用于标记含

4、酪氨酸或组氨酸的化合物；含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。性，则该活性易因标记而受损伤。优点：优点： 可标记缺乏酪氨酸或组氨酸的肽类及某些可标记缺乏酪氨酸或组氨酸的肽类及某些蛋白质；蛋白质；标记反应较为温和，可以避免因蛋白标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入质直接加入125125I I液引起的生物活性的丧失。液引起的生物活性的丧失。缺点：由于操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显缺点：由于操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。著低于直接法。（2 2）间接标记法（又称连接法）：）间接标记法（又称连接法）：

5、是以是以125125I I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。（二）标记物的纯化（二）标记物的纯化1.1.凝胶过滤法（分子筛）凝胶过滤法（分子筛）2.2.离子交换层析法离子交换层析法3.PAGE3.PAGE4.4.高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）（三）标记物的鉴定 1.1.放射化学纯度：放射化学纯度：一般要求大于一般要求大于95952.2.比放射活性：比放射活性：指单位质量标记物中所含指单位质量标记物中所含的放射强度。用的放射强度。用mCi/mgmCi/mg（或（或mCi/mmolmCi/mmol）表示。表示。比度越高，测定越敏感。比度越高

6、，测定越敏感。3.3.免疫活性：免疫活性：B/TB/T在在8080以上，该值越大，以上，该值越大，表示抗原损伤越少。表示抗原损伤越少。19591959年年 YalowYalow和和BersonBerson创建，创建，19771977年年 YalowYalow获诺贝尔奖金。获诺贝尔奖金。第二节第二节 放射免疫分析放射免疫分析radioimmunoassay，RIA显著特点：显著特点：具有高度的敏感性（高达具有高度的敏感性（高达ngng甚至甚至pgpg水水平）平） 、特异性和精确性，特别适用于微量蛋白、特异性和精确性，特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。质、激素和多肽的定量测定。一、基本原

7、理一、基本原理 标记抗原（标记抗原（AgAg* *）和非标记抗原（）和非标记抗原（AgAg）对特异）对特异性抗体（性抗体（AbAb）的）的竞争竞争结合反应。结合反应。 放射免疫分析放射免疫分析是以核素标记的抗原与受检是以核素标记的抗原与受检标本中抗原标本中抗原竞争竞争特异性抗体来测定待检样品中特异性抗体来测定待检样品中抗原含量的方法。为经典模式。抗原含量的方法。为经典模式。 由于标记抗原与特异由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，性抗体的量是固定的，故标记免疫复合物的故标记免疫复合物的量就随着待检抗原的量就随着待检抗原的量而改变量而改变。 （二）实验方法（二）实验方法AgAg* *AgAgAb

8、Ab反应条件反应条件体积体积温度温度时间时间pHpH平衡法平衡法非平衡法非平衡法抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应 如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（常数较大，可选择较高的温度（15153737）进行较短时间的温育，反之应在低温（进行较短时间的温育，反之应在低温（44）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。物较为牢固。 免疫复合物（免疫复合物（B B）与游离标记物（）与游离标记物（F F）的分离）的分离聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法双抗体法双抗体法双抗体双抗体-PEG法法

9、 是一种将双抗体与是一种将双抗体与PEG二法相二法相结合的方法。此法保持了两者结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。而且分离快速、简便。晶体闪烁计数器晶体闪烁计数器包括了包括了NaINaI闪烁晶闪烁晶体、光电倍增管以体、光电倍增管以及计数器及计数器测量的放射性信测量的放射性信号是仪器输出的号是仪器输出的电脉冲数：每分钟电脉冲数：每分钟计数计数(cpm) (cpm) 计算计算 参数参数cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)拟合拟合注：注：T T即是

10、即是B B与与F F的总和的总和标准曲线放射强度测定放射强度测定 数据处理数据处理 ICIC中的放射性强度与受检标本中抗原的浓中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈度呈反比反比。 Ag的量的量反应式反应式B/F值值04Ag*+0Ag+3Ab-3Ag*Ab+Ag*3/124Ag*+2Ag+3Ab-2Ag*Ab+1AgAb+2Ag*+1Ag2/284Ag*+8Ag+3Ab-1Ag*Ab+2AgAb+3Ag*+6Ag1/3免疫放射分析（免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）是用放射性核素标记的过量抗体是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体

11、与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的分离结合与游离标记抗体的非竞争非竞争放射免疫分放射免疫分析。析。第二节免疫放射分析第二节免疫放射分析Ag-Ag-* *AbAb复合物的放射性强度与待测抗原的量成正比关系复合物的放射性强度与待测抗原的量成正比关系（待测）（待测）（已知）（已知）一、基本原理一、基本原理 单位点单位点IRMAIRMA：（1 1）放射性核素标记的过量抗体）放射性核素标记的过量抗体+ +待测抗原，形成抗原抗体复合物；（待测抗原，形成抗原抗体复合物；（2 2）反应平衡）反应平衡后，采用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标后，采用固相抗原结合反应液中剩余的未结合

12、标记抗体并将其分离；（记抗体并将其分离；（3 3）测定）测定上清液上清液的放射量。的放射量。双位点双位点IRMAIRMA：先用固相抗体跟抗原反应结合，然后先用固相抗体跟抗原反应结合，然后再用放射性核素标记的过量抗体与已结合于固相抗再用放射性核素标记的过量抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定蔟结合，形成原的另一抗原决定蔟结合，形成固相抗体固相抗体- -抗原抗原- -标标记抗体复合物（双抗体夹心）记抗体复合物（双抗体夹心），洗弃反应液中剩余，洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。的标记抗体，测定固相上的放射性。 （待测）（待测）不论是单位点还是双位点不论是单位点还是双位点IRMAIRMA，最后测，最后测得的放射性与受检抗原的量得的放射性与受检抗原的量呈正比呈正比。四、IRMA与RIA比较应 用 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等物和药物等微量物质微量物质的测定。的测定。 由于其具有放射污染和危害，常用核素半由于其具有放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长，以及具有不衰期短，试剂盒稳定期不长，以及具有不易快速、灵活的自动化分析